ما هو مقدار القالب الذي يجب أن نضيفه إلى تفاعل PCR الخاص بي؟

مع أن جزيئًا واحدًا من القالب يكفي نظريًا، إلا أنه عادةً ما تُستخدم كميات أكبر بكثير من الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، على سبيل المثال، ما يصل إلى ميكروغرام واحد من الحمض النووي الجينومي للثدييات، وبيكوغرام واحد فقط من الحمض النووي البلازميدي. تعتمد الكمية المثلى بشكل كبير على عدد نسخ التسلسل المستهدف، بالإضافة إلى تعقيده.

إذا تم استخدام قالب صغير جدًا، فستكون هناك حاجة إلى زيادة مقابلة في عدد دورات التضخيم للحصول على كمية كافية من المنتج. لا يتميز بوليميراز Taq المستخدم في معظم تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بوظيفة تصحيح (نشاط نوكلياز خارجي 3'-5')؛ وبالتالي، لا يمكن تصحيح الأخطاء التي تحدث أثناء التضخيم. كلما زاد عدد الدورات، زاد انتشار تضخيم المنتج المعيب. من ناحية أخرى، إذا كانت كمية القالب عالية جدًا، فإن احتمالية تلدين البادئات بتسلسلات أخرى (ليست متكاملة تمامًا)، بالإضافة إلى تكوين ثنائيات البادئ، ستزداد، مما سيؤدي إلى تضخيم المنتجات الثانوية. في كثير من الحالات، يتم عزل الحمض النووي من مزارع الخلايا أو من الكائنات الدقيقة واستخدامه لاحقًا كقالب تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد التنقية، من الضروري تحديد تركيز الحمض النووي للتمكن من تحديد الحجم المطلوب لإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل. مع أن التحليل الكهربائي للهلام الآغاروزي قد يُفيد في تقدير التركيز، إلا أن هذه الطريقة بعيدة كل البعد عن الدقة. وقد اعتُبرت تقنية مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية المعيار الذهبي لقياس الأحماض النووية؛ إذ تقيس هذه الطريقة المباشرة، وبالتالي السهلة والسريعة، امتصاص العينة عند طول موجي 260 نانومتر، ويُحسب التركيز باستخدام عامل تحويل.

إذا كان تركيز الحمض النووي منخفضًا جدًا (<1 ميكروغرام/مل من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين ثنائي التكافؤ)، أو إذا كان ملوثًا بمواد تمتص أيضًا في نطاق 260 نانومتر (مثل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين والبروتين والأملاح)، فستصل هذه الطريقة إلى حدودها. في حالة التركيزات المنخفضة جدًا، ستصبح القراءات غير دقيقة جدًا بحيث لا يمكن استخدامها، وستؤدي التلوثات إلى المبالغة (الهائلة أحيانًا) في تقدير القيمة الفعلية. في هذه الحالة، قد يقدم التقدير الكمي باستخدام الفلورسنت بديلاً. تعتمد هذه التقنية على استخدام صبغة فلورية ترتبط بشكل خاص بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين ثنائي التكافؤ فقط، حيث يُثار المركب المكون من الحمض النووي والصبغة بواسطة الضوء، وسيصدر بعد ذلك ضوءًا بطول موجي أعلى قليلاً. هنا، تكون شدة الإشارة الفلورية متناسبة مع كمية الحمض النووي، ولتحديد التركيز يتم تقييمها فيما يتعلق بمنحنى قياسي. تكمن مزايا هذه الطريقة في خصوصية الرابطة، التي تُستبعد التأثيرات الخارجية الناتجة عن التلوث، بالإضافة إلى قدرتها على اكتشاف تركيزات منخفضة جدًا من الحمض النووي. تعتمد ملاءمة أيٍّ من الطريقتين بشكل أساسي على تركيز العينة ونقائها؛ وفي كثير من الحالات، قد يُنصح بتطبيق الطريقتين بالتوازي.