Alhoewel een molekule van die templaat in teorie voldoende sou wees, word aansienlik groter hoeveelhede DNA tipies vir 'n klassieke PCR gebruik, byvoorbeeld tot 1 µg genomiese soogdier-DNS en so min as 1 pg plasmied-DNS. Die optimale hoeveelheid hang grootliks af van die aantal kopieë van die teikenvolgorde, sowel as van die kompleksiteit daarvan.
Indien baie min templaat gebruik word, sal 'n ooreenstemmende toename in die aantal amplifikasiesiklusse nodig wees om 'n voldoende hoeveelheid produk te verkry. 'n Taq-polimerase wat vir die meeste PCR-eksperimente gebruik word, beskik nie oor 'n korreksiefunksie (3′-5′ eksonuklease-aktiwiteit) nie; dus kan foute wat tydens amplifikasie voorkom, nie reggestel word nie. Hoe hoër die aantal siklusse, hoe meer algemeen sal die amplifikasie van die gebrekkige produk wees. Indien die hoeveelheid templaat aan die ander kant te hoog is, sal die waarskynlikheid dat primers aan ander (nie honderd persent komplementêre) volgordes sal anneal, sowel as die vorming van primer-dimere, toeneem, wat sal lei tot die amplifikasie van neweprodukte. In baie gevalle word DNS uit selkulture of uit mikroörganismes geïsoleer en vervolgens as 'n PCR-templaat gebruik. Na suiwering is dit nodig om die konsentrasie van die DNS te bepaal om die volume wat vir die PCR-opstelling benodig word, te kan definieer. Terwyl agarosegel-elektroforese 'n skatting kan verskaf, is hierdie metode ver van akkuraat. UV-Vis-spektrofotometrie is gevestig as die goue standaard vir die kwantifisering van nukleïensure; Hierdie direkte en dus maklike en vinnige metode meet die absorbansie van die monster teen 260 nm, en die konsentrasie word bereken met behulp van 'n omskakelingsfaktor.
Indien die DNS-konsentrasie egter baie laag is (< 1 µg/mL dsDNS), of indien dit besmet is met stowwe wat ook in die 260 nm-reeks absorbeer (bv. RNS, proteïen, soute), sal hierdie metode sy beperkings bereik. In die geval van baie lae konsentrasies sal die lesings gou te onakkuraat word om van nut te wees, en kontaminasies sal lei tot (soms enorme) oorskatting van die werklike waarde. In hierdie geval kan kwantifisering met behulp van fluoresensie 'n alternatief bied. Hierdie tegniek is gebaseer op die gebruik van 'n fluorescerende kleurstof wat spesifiek aan dsDNS bind - slegs die kompleks wat nukleïensuur en kleurstof bevat, word deur die lig opgewek, en dit sal gevolglik lig van 'n effens hoër golflengte uitstraal. Hier is die intensiteit van die fluorescerende sein eweredig aan die hoeveelheid DNS, en vir die bepaling van die konsentrasie word dit geëvalueer in verhouding tot 'n standaardkurwe. Die voordele van hierdie metode berus op die spesifisiteit van die binding, wat die eksterne invloede wat deur kontaminasie ingestel word, uitsluit, sowel as op die gevolglike vermoë om baie lae konsentrasies DNS op te spoor. Die geskiktheid van enige metode hang hoofsaaklik af van monsterkonsentrasie en suiwerheid; in baie gevalle kan dit selfs raadsaam wees om beide metodes parallel toe te pas.
Plasingstyd: 30 Nov 2022