Për reaksione të suksesshme amplifikimi, është e nevojshme që përbërësit individualë të reaksionit të jenë të pranishëm në përqendrimin e saktë në secilin preparat. Përveç kësaj, është e rëndësishme që të mos ndodhë ndotje.
Sidomos kur duhet të përgatiten shumë reaksione, është vendosur të përgatitet e ashtuquajtura përzierje kryesore në vend që të pipetohet secili reagent veçmas në secilën enë. Përzierjet e parakonfiguruara janë të disponueshme në treg, në të cilat shtohen vetëm përbërës specifikë për mostrën (primer) dhe ujë. Si alternativë, përzierja kryesore mund të përgatitet vetë. Në të dyja variantet, përzierja shpërndahet në secilën enë PCR pa shabllon dhe mostra individuale e ADN-së shtohet veçmas në fund.
Përdorimi i një përzierjeje kryesore ka disa përparësi: Së pari, zvogëlohet numri i hapave të vetëm të pipetimit. Në këtë mënyrë, minimizohet si rreziku i gabimeve të përdoruesit gjatë pipetimit ashtu edhe rreziku i kontaminimit dhe, sigurisht, kursehet kohë. Në parim, saktësia e pipetimit është gjithashtu më e lartë, pasi dozohen vëllime më të mëdha. Kjo është e lehtë për t'u kuptuar kur kontrollohen të dhënat teknike të pipetave: Sa më i vogël të jetë vëllimi i dozuar, aq më të larta mund të jenë devijimet. Fakti që të gjitha përgatitjet vijnë nga e njëjta enë ka një efekt pozitiv në homogjenitet (nëse përzihen mirë). Kjo gjithashtu përmirëson riprodhueshmërinë e eksperimenteve.
Gjatë përgatitjes së përzierjes kryesore, duhet të shtohet të paktën 10% vëllim shtesë (p.sh., nëse kërkohen 10 përgatitje, llogaritni në bazë të 11), në mënyrë që edhe ena e fundit të mbushet siç duhet. Në këtë mënyrë, mund të kompensohen pasaktësitë (e vogla) të pipetimit dhe efekti i humbjes së mostrës gjatë dozimit të tretësirave që përmbajnë detergjent. Detergjentët përmbahen në tretësira enzimatike si polimerazat dhe përzierjet kryesore, duke shkaktuar formimin e shkumës dhe mbetjeve në sipërfaqen e brendshme të normales.majat e pipetave.
Në varësi të aplikimit dhe llojit të lëngut që do të shpërndahet, duhet të zgjidhet teknika e saktë e pipetimit (1) dhe pajisjet e përshtatshme. Për tretësirat që përmbajnë detergjentë, rekomandohet një sistem zhvendosjeje direkte ose të ashtuquajturat maja pipetash "me mbajtje të ulët" si alternativë për pipetat me jastëk ajri. Efekti iMaja e pipetës ACEbazohet në një sipërfaqe veçanërisht hidrofobe. Lëngjet që përmbajnë detergjentë nuk lënë një film mbetjesh brenda dhe jashtë, në mënyrë që humbja e tretësirës të minimizohet.
Përveç dozimit të saktë të të gjithë përbërësve, është gjithashtu e rëndësishme që të mos ndodhë ndotje e përgatitjeve. Nuk mjafton të përdoren materiale harxhuese me pastërti të lartë, sepse procesi i pipetimit në një pipetë me jastëk ajri mund të prodhojë aerosole që mbeten në pipetë. ADN-ja që mund të përmbahet në aerosol mund të transferohet nga një mostër në tjetrën në hapin pasues të pipetimit dhe kështu të çojë në ndotje. Sistemet e zhvendosjes direkte të përmendura më sipër gjithashtu mund ta minimizojnë këtë rrezik. Për pipetat me jastëk ajri ka kuptim të përdoren maja filtri për të mbrojtur konin e pipetës duke mbajtur spërkatjet, aerosolet dhe biomolekulat.
Koha e postimit: 06 Dhjetor 2022