増幅反応を成功させるには、個々の反応成分が各調製物中に正しい濃度で存在することが必要です。さらに、汚染が生じないことが重要です。
特に多くの反応をセットアップする必要がある場合、各試薬を各容器に個別にピペットで移す代わりに、いわゆるマスターミックスを準備することが確立されています。サンプル固有の成分 (プライマー) と水のみが添加された、事前に構成された混合物が市販されています。あるいは、マスターミックスを自分で準備することもできます。どちらのバリエーションでも、混合物はテンプレートなしで各 PCR 容器に分配され、個々の DNA サンプルが最後に個別に追加されます。
マスター ミックスを使用すると、いくつかの利点があります。 まず、1 回のピペッティング ステップの数が減ります。このようにして、ピペッティング中のユーザーエラーのリスクと汚染のリスクの両方が最小限に抑えられ、もちろん時間が節約されます。原理的には、より大量の分注が行われるため、ピペット操作の精度も高くなります。これは、ピペットの技術データを確認すると簡単に理解できます。投与量が少ないほど、偏差が大きくなる可能性があります。すべての調製物が同じ容器から得られるという事実は、（よく混合された場合）均一性にプラスの効果をもたらします。これにより、実験の再現性も向上します。
マスターミックスを調製するときは、最後の容器まで適切に満たされるように、少なくとも 10 % の追加容量を追加する必要があります (たとえば、10 回の調製が必要な場合は、11 に基づいて計算します)。このようにして、（わずかな）ピペッティングの不正確さ、および界面活性剤を含む溶液を分注する際のサンプル損失の影響を補償することができます。界面活性剤はポリメラーゼやマスターミックスなどの酵素溶液に含まれており、通常の洗浄剤の内面に泡の形成や残留物の原因となります。ピペットチップ.
用途と分注する液体の種類に応じて、正しいピペッティング技術 (1) を選択し、適切な機器を選択する必要があります。洗剤を含む溶液の場合は、直接置換システム、またはエアクッション ピペットの代替品としていわゆる「低保持」ピペット チップが推奨されます。の効果エースピペットチップ特に疎水性の表面に基づいています。洗剤を含む液体でも内外に残留膜が残らないため、溶液の損失を最小限に抑えることができます。
すべての成分を正確に投与することに加えて、製剤の汚染が起こらないことも重要です。エアクッションピペットでのピペッティングプロセスでは、ピペット内に残るエアロゾルが生成される可能性があるため、高純度の消耗品を使用するだけでは十分ではありません。エアロゾルに含まれる可能性のある DNA は、次のピペット操作ステップで 1 つのサンプルから次のサンプルに移動し、汚染を引き起こす可能性があります。上述の直接置換システムもこのリスクを最小限に抑えることができます。エアクッション ピペットの場合、飛沫、エアロゾル、生体分子を保持してピペット コーンを保護するためにフィルター チップを使用するのが合理的です。
投稿時間: 2022 年 12 月 6 日