For vellykkede amplifikasjonsreaksjoner er det nødvendig at de enkelte reaksjonskomponentene er tilstede i riktig konsentrasjon i hvert preparat.I tillegg er det viktig at det ikke oppstår forurensning.
Spesielt når mange reaksjoner skal settes opp, er det etablert å tilberede en såkalt mastermix i stedet for å pipettere hver reagens separat i hvert kar.Forhåndskonfigurerte blandinger er kommersielt tilgjengelige, der bare prøvespesifikke komponenter (primer) og vann tilsettes.Alternativt kan masterblandingen tilberedes selv.I begge variantene fordeles blandingen til hvert PCR-kar uten mal og den individuelle DNA-prøven tilsettes separat på slutten.
Å bruke en mastermiks har flere fordeler: For det første reduseres antallet enkeltpipetteringstrinn.På denne måten minimeres både risikoen for brukerfeil under pipettering og risikoen for kontaminering, og selvfølgelig spares tid.I prinsippet er pipetteringsnøyaktigheten også høyere, siden større volumer doseres.Dette er lett å forstå når man sjekker de tekniske dataene til pipetter: Jo mindre dosert volum, jo større kan avvikene være.Det faktum at alle preparater kommer fra samme kar har en positiv effekt på homogeniteten (hvis godt blandet).Dette forbedrer også reproduserbarheten til forsøkene.
Ved tilberedning av masterblandingen bør det tilsettes minst 10 % ekstra volum (f.eks. hvis 10 preparater kreves, beregn på grunnlag av 11), slik at selv den siste karen fylles skikkelig.På denne måten kan (små) pipetteringsunøyaktigheter og effekten av prøvetap ved dosering av vaskemiddelholdige løsninger kompenseres.Vaskemidler finnes i enzymløsninger som polymeraser og masterblandinger, noe som forårsaker skumdannelse og rester på den indre overflaten av normalpipettespisser.
Avhengig av applikasjonen og typen væske som skal dispenseres, bør riktig pipeteringsteknikk (1) velges og passende utstyr velges.For løsninger som inneholder vaskemidler, anbefales et direkte fortrengningssystem eller såkalte pipettespisser med lav retensjon som et alternativ for luftputepipetter.Virkningen avACE PIPETTE-spisser basert på en spesielt hydrofob overflate.Væsker som inneholder vaskemidler etterlater ikke en restfilm på innsiden og utsiden, slik at tapet av løsning kan minimeres.
Foruten nøyaktig dosering av alle komponenter, er det også viktig at det ikke oppstår kontaminering av preparatene.Det er ikke tilstrekkelig å bruke forbruksvarer med høy renhet, fordi pipeteringsprosessen i en luftputepipette kan produsere aerosoler som blir igjen i pipetten.DNAet som kan være inneholdt i aerosolen kan overføres fra en prøve til den neste i følgende pipeteringstrinn og dermed føre til kontaminering.De direkte forskyvningssystemene nevnt ovenfor kan også minimere denne risikoen.For luftputepipetter er det fornuftig å bruke filterspisser for å beskytte pipettekjeglen ved å holde på sprut, aerosoler og biomolekyler.
Innleggstid: Des-06-2022