לתגובות הגברה מוצלחות, יש צורך שמרכיבי התגובה הבודדים יהיו נוכחים בריכוז הנכון בכל תכשיר.בנוסף, חשוב שלא יתרחש זיהום.
במיוחד כאשר יש להגדיר תגובות רבות, נקבע להכין מה שנקרא תערובת מאסטר במקום להטביע כל מגיב בנפרד לתוך כל כלי.תערובות מוגדרות מראש זמינות מסחרית, שבהן מוסיפים רק רכיבים ספציפיים לדגימה (פריימר) ומים.לחלופין, ניתן להכין את תערובת המאסטר בעצמך.בשתי הגרסאות, התערובת מופצת לכל כלי PCR ללא תבנית ודגימת ה-DNA הבודדת מתווספת בנפרד בסוף.
לשימוש בתמהיל מאסטר יש מספר יתרונות: ראשית, מספר שלבי הפיפטציה הבודדים מצטמצם.בדרך זו, הן הסיכון לטעויות המשתמש במהלך הפיפטציה והן הסיכון לזיהום ממוזערים וכמובן נחסך זמן.באופן עקרוני, גם דיוק הפיפטינג גבוה יותר, מכיוון שמנתנים נפחים גדולים יותר.קל להבין זאת כאשר בודקים את הנתונים הטכניים של פיפטות: ככל שנפח המינון קטן יותר, כך הסטיות יכולות להיות גבוהות יותר.לעובדה שכל התכשירים מגיעים מאותו כלי יש השפעה חיובית על ההומוגניות (אם מעורבבים היטב).זה גם משפר את יכולת השחזור של הניסויים.
בעת הכנת תערובת המאסטר, יש להוסיף לפחות 10% נפח נוסף (למשל אם נדרשות 10 הכנות, חשבו על בסיס 11), כך שאפילו הכלי האחרון יתמלא כראוי.בדרך זו ניתן לפצות על אי דיוקים (קלים) בפיפטציה, והשפעת אובדן הדגימה בעת מינון תמיסות המכילות חומר ניקוי.חומרי ניקוי כלולים בתמיסות אנזימים כגון פולימראזות ותערובות מאסטר, הגורמים להיווצרות קצף ושאריות על פני השטח הפנימיים של נורמליקצות פיפטה.
בהתאם ליישום ולסוג הנוזל לחלוקה, יש לבחור את טכניקת הפיפטציה הנכונה (1) ולבחור את הציוד המתאים.עבור תמיסות המכילות חומרי ניקוי, מומלצת מערכת תזוזה ישירה או קצות פיפטות "אחזקות נמוכה" כחלופה לפיפטות של כרית אוויר.האפקט שלטיפ של ACE PIPETTEמבוסס על משטח הידרופובי במיוחד.נוזלים המכילים חומרי ניקוי אינם משאירים שכבת שאריות מבפנים ומבחוץ, כך שניתן למזער את איבוד התמיסה.
מלבד המינון המדויק של כל הרכיבים, חשוב גם שלא יתרחש זיהום של התכשירים.זה לא מספיק להשתמש בחומרים מתכלים בטוהר גבוה, מכיוון שתהליך הפיפטה בפיפטה של כרית אוויר יכול לייצר אירוסולים שנשארים בפיפטה.ניתן להעביר את ה-DNA שעשוי להכיל את התרסיס מדגימה אחת לאחרת בשלב הפיפטינג הבא וכך להוביל לזיהום.מערכות העקירה הישירה שהוזכרו לעיל עשויות גם למזער סיכון זה.עבור פיפטות של כרית אוויר, הגיוני להשתמש בקצות סינון כדי להגן על חרוט הפיפטה על ידי שמירה על ניתזים, אירוסולים וביומולקולות.
זמן פרסום: דצמבר 06-2022