För framgångsrika amplifieringsreaktioner är det nödvändigt att de enskilda reaktionskomponenterna är närvarande i rätt koncentration i varje beredning.Dessutom är det viktigt att ingen kontaminering sker.
Speciellt när många reaktioner måste ställas in har man fastställt att man förbereder en så kallad mastermix istället för att pipettera varje reagens separat i varje kärl.Förkonfigurerade blandningar finns kommersiellt tillgängliga, där endast provspecifika komponenter (primer) och vatten tillsätts.Alternativt kan mastermixen förberedas av dig själv.I båda varianterna fördelas blandningen till varje PCR-kärl utan mall och det individuella DNA-provet tillsätts separat i slutet.
Att använda en mastermix har flera fördelar: För det första minskas antalet enstaka pipeteringssteg.På så sätt minimeras både risken för användarfel vid pipettering och risken för kontaminering och givetvis sparas tid.I princip är pipetteringsnoggrannheten också högre, eftersom större volymer doseras.Detta är lätt att förstå när man kontrollerar pipetters tekniska data: Ju mindre doserad volym, desto större kan avvikelserna vara.Det faktum att alla preparat kommer från samma kärl har en positiv effekt på homogeniteten (om de är väl blandade).Detta förbättrar också reproducerbarheten av experimenten.
Vid beredning av mastermixen bör minst 10 % extra volym tillsättas (t.ex. om 10 preparat krävs, beräkna utifrån 11), så att även det sista kärlet fylls ordentligt.På så sätt kan (små) pipetteringsfel och effekten av provförlust vid dosering av rengöringsmedelslösningar kompenseras.Detergenter finns i enzymlösningar som polymeraser och mastermixar, vilket orsakar skumbildning och rester på insidan av normalpipettspetsar.
Beroende på applikationen och vilken typ av vätska som ska dispenseras, ska rätt pipeteringsteknik (1) väljas och lämplig utrustning väljas.För lösningar som innehåller rengöringsmedel rekommenderas ett direktförskjutningssystem eller så kallade "låg retention" pipettspetsar som ett alternativ för luftkuddepipetter.Effekten avACE PIPETTT spetsär baserad på en särskilt hydrofob yta.Vätskor som innehåller tvättmedel lämnar ingen restfilm på insidan och utsidan, så att förlusten av lösning kan minimeras.
Förutom den exakta doseringen av alla komponenter är det också viktigt att ingen kontaminering av preparaten sker.Det är inte tillräckligt att använda förbrukningsvaror med hög renhet, eftersom pipetteringsprocessen i en luftkuddepipett kan producera aerosoler som blir kvar i pipetten.Det DNA som kan finnas i aerosolen kan överföras från ett prov till nästa i följande pipeteringssteg och därmed leda till kontaminering.De direktförskjutningssystem som nämns ovan kan också minimera denna risk.För luftkuddepipetter är det vettigt att använda filterspetsar för att skydda pipettkonen genom att hålla kvar stänk, aerosoler och biomolekyler.
Posttid: Dec-06-2022