Für erfolgreiche Amplifikationsreaktionen ist es notwendig, dass die einzelnen Reaktionskomponenten in jedem Präparat in der richtigen Konzentration vorliegen.Darüber hinaus ist es wichtig, dass keine Verunreinigungen auftreten.
Insbesondere wenn viele Reaktionen angesetzt werden müssen, hat es sich etabliert, einen sogenannten Mastermix herzustellen, anstatt jedes Reagenz einzeln in jedes Gefäß zu pipettieren.Im Handel sind vorkonfigurierte Mischungen erhältlich, denen lediglich probenspezifische Komponenten (Primer) und Wasser zugesetzt werden.Alternativ kann der Mastermix auch selbst hergestellt werden.Bei beiden Varianten wird die Mischung ohne Vorlage auf jedes PCR-Gefäss verteilt und die einzelne DNA-Probe am Ende separat hinzugefügt.
Die Verwendung eines Mastermixes hat mehrere Vorteile: Erstens wird die Anzahl der einzelnen Pipettierschritte reduziert.Auf diese Weise wird sowohl das Risiko von Benutzerfehlern beim Pipettieren als auch das Kontaminationsrisiko minimiert und natürlich auch Zeit gespart.Grundsätzlich ist auch die Pipettiergenauigkeit höher, da größere Volumina dosiert werden.Bei der Überprüfung der technischen Daten von Pipetten lässt sich das leicht nachvollziehen: Je kleiner das dosierte Volumen, desto höher können die Abweichungen sein.Die Tatsache, dass alle Zubereitungen aus dem gleichen Gefäß stammen, wirkt sich positiv auf die Homogenität aus (bei guter Durchmischung).Dies verbessert auch die Reproduzierbarkeit der Experimente.
Bei der Zubereitung des Mastermixes sollten mindestens 10 % Extravolumen hinzugegeben werden (z. B. bei 10 Zubereitungen mit 11 rechnen), damit auch das letzte Gefäß richtig gefüllt wird.Auf diese Weise können (geringfügige) Pipettierungenauigkeiten und der Einfluss von Probenverlusten bei der Dosierung von reinigungsmittelhaltigen Lösungen ausgeglichen werden.Reinigungsmittel sind in Enzymlösungen wie Polymerasen und Mastermixen enthalten und verursachen Schaumbildung und Rückstände auf der Innenoberfläche von NormalwaschmittelnPipettenspitzen.
Abhängig von der Anwendung und der Art der zu dosierenden Flüssigkeit sollte die richtige Pipettiertechnik (1) gewählt und die entsprechende Ausrüstung ausgewählt werden.Für detergenshaltige Lösungen empfiehlt sich als Alternative zu Luftpolsterpipetten ein Direktverdrängungssystem oder die sogenannten „Low Retention“-Pipettenspitzen.Der Effekt vonACE PIPETTE-Spitzebasiert auf einer besonders hydrophoben Oberfläche.Waschmittelhaltige Flüssigkeiten hinterlassen auf der Innen- und Außenseite keinen Rückstandsfilm, so dass der Lösungsverlust minimiert werden kann.
Neben der exakten Dosierung aller Komponenten ist es auch wichtig, dass es zu keiner Verunreinigung der Präparate kommt.Es reicht nicht aus, Verbrauchsmaterialien mit hoher Reinheit zu verwenden, da beim Pipettieren in einer Luftpolsterpipette Aerosole entstehen können, die in der Pipette verbleiben.Die gegebenenfalls im Aerosol enthaltene DNA kann im folgenden Pipettierschritt von einer Probe auf die nächste übertragen werden und so zu einer Kontamination führen.Auch die oben erwähnten Direktverdrängungssysteme können dieses Risiko minimieren.Bei Luftpolsterpipetten ist es sinnvoll, Filterspitzen zu verwenden, um den Pipettenkonus zu schützen und Spritzer, Aerosole und Biomoleküle zurückzuhalten.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 06.12.2022