За успешне реакције амплификације, неопходно је да појединачне компоненте реакције буду присутне у тачној концентрацији у сваком препарату.Поред тога, важно је да не дође до контаминације.
Нарочито када је потребно подесити многе реакције, установљено је да се припрема такозвана мастер мешавина уместо пипетирања сваког реагенса посебно у сваку посуду.Унапред конфигурисане мешавине су комерцијално доступне, у које се додају само компоненте специфичне за узорак (прајмер) и вода.Алтернативно, главну мешавину можете припремити сами.У обе варијанте, смеша се дистрибуира у сваки ПЦР суд без шаблона и појединачни узорак ДНК се додаје посебно на крају.
Употреба главне мешавине има неколико предности: Прво, смањује се број појединачних корака пипетирања.На овај начин, ризик од грешака корисника током пипетирања и ризик од контаминације су минимизирани и, наравно, уштеђено време.У принципу, тачност пипетирања је такође већа, јер се дозирају веће количине.Ово је лако разумети приликом провере техничких података пипета: Што је дозирана запремина мања, одступања могу бити већа.Чињеница да сви препарати потичу из исте посуде позитивно утиче на хомогеност (ако су добро измешани).Ово такође побољшава поновљивост експеримената.
Приликом припреме мастер мешавине треба додати најмање 10% додатне запремине (нпр. ако је потребно 10 припрема, израчунајте на основу 11), тако да се и последња посуда правилно напуни.На овај начин се могу компензовати (мале) непрецизности пипетирања и ефекат губитка узорка при дозирању раствора који садрже детерџенте.Детерџенти се налазе у растворима ензима као што су полимеразе и мастер мешавине, узрокујући стварање пене и остатака на унутрашњој површини нормалногврхови пипете.
У зависности од примене и врсте течности која се дозира, треба изабрати исправну технику пипетирања (1) и одабрати одговарајућу опрему.За растворе који садрже детерџенте, препоручује се систем директног померања или такозвани врхови пипета са „малим задржавањем“ као алтернатива за пипете са ваздушним јастуком.ЕфекатАЦЕ ПИПЕТТЕ врхзаснива се на посебно хидрофобној површини.Течности које садрже детерџенте не остављају филм остатака изнутра и споља, тако да се губитак раствора може свести на минимум.
Поред тачног дозирања свих компоненти, важно је и да не дође до контаминације препарата.Није довољно користити потрошни материјал високе чистоће, јер процес пипетирања у пипети са ваздушним јастуком може произвести аеросоле који остају у пипети.ДНК која може бити садржана у аеросолу може се пренети са једног узорка на други у следећем кораку пипетирања и тако довести до контаминације.Горе наведени системи директног померања такође могу минимизирати овај ризик.За пипете са ваздушним јастуком има смисла користити врхове филтера за заштиту конуса пипете задржавањем прскања, аеросола и биомолекула.
Време поста: 06.12.2022