Chuẩn hóa các quy trình bao gồm việc tối ưu hóa và thiết lập và hài hòa sau đó, cho phép hiệu suất tối ưu lâu dài – không phụ thuộc vào người dùng. Chuẩn hóa đảm bảo kết quả chất lượng cao, cũng như khả năng tái tạo và so sánh của chúng.
Mục tiêu của PCR (cổ điển) là tạo ra kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo. Đối với một số ứng dụng nhất định, sản lượng củaSản phẩm PCRcũng có liên quan. Đối với những phản ứng này, cần phải cẩn thận để đảm bảo rằng các mẫu không bị ảnh hưởng và quy trình PCR vẫn ổn định. Cụ thể, điều này có nghĩa là giảm thiểu việc đưa vào các chất gây ô nhiễm có thể dẫn đến kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả hoặc thậm chí ức chế phản ứng PCR. Hơn nữa, các điều kiện phản ứng phải giống hệt nhau nhất có thể đối với từng mẫu riêng lẻ trong một lần chạy và cũng có thể chuyển sang các phản ứng tiếp theo (cùng phương pháp). Điều này liên quan đến thành phần của các phản ứng cũng như loại kiểm soát nhiệt độ trong chu trình. Tất nhiên, cần tránh tối đa các lỗi của người dùng.
Dưới đây, chúng tôi sẽ trình bày những thách thức gặp phải trong quá trình chuẩn bị và trong suốt quá trình thực hiện PCR – và các giải pháp hiện có liên quan đến các thiết bị và vật tư tiêu hao được sử dụng để chuẩn hóa quy trình làm việc PCR.
Chuẩn bị phản ứng
Việc phân phối các thành phần phản ứng vào các bình PCR hoặc đĩa PCR bao gồm nhiều thách thức cần phải vượt qua:
Điều kiện phản ứng
Việc định lượng chính xác và tỉ mỉ các thành phần riêng lẻ là điều không thể thiếu khi hướng đến các điều kiện phản ứng giống hệt nhau nhất có thể. Ngoài kỹ thuật hút mẫu tốt, việc lựa chọn đúng công cụ cũng rất quan trọng. Các hỗn hợp PCR master thường chứa các chất làm tăng độ nhớt hoặc tạo bọt. Trong quá trình hút mẫu, những chất này dẫn đến việc làm ướt đáng kểđầu pipet, do đó làm giảm độ chính xác của pipet. Việc sử dụng hệ thống phân phối trực tiếp hoặc đầu pipet thay thế ít bị ướt hơn có thể cải thiện độ chính xác và độ chính xác của quy trình hút.
Ô nhiễm
Trong quá trình phân phối, các hạt khí dung được tạo ra, nếu để lọt vào bên trong pipet, có khả năng làm nhiễm bẩn mẫu khác trong bước hút tiếp theo. Điều này có thể được ngăn ngừa bằng cách sử dụng đầu lọc hoặc hệ thống dịch chuyển trực tiếp.
Vật tư tiêu hao nhưmẹo, các bình và đĩa được sử dụng trong quy trình PCR không được chứa các chất làm ảnh hưởng đến mẫu hoặc làm sai lệch kết quả. Chúng bao gồm DNA, DNase, RNase và chất ức chế PCR, cũng như các thành phần có khả năng rò rỉ từ vật liệu trong quá trình phản ứng – các chất được gọi là chất có thể rò rỉ.
Lỗi người dùng
Càng xử lý nhiều mẫu, rủi ro lỗi càng cao. Có thể dễ dàng xảy ra trường hợp mẫu được hút vào nhầm bình hoặc nhầm giếng. Rủi ro này có thể giảm đáng kể bằng cách đánh dấu giếng dễ nhận biết. Thông qua việc tự động hóa các bước phân phối, “yếu tố con người”, tức là lỗi và các biến thể liên quan đến người dùng, được giảm thiểu, do đó tăng khả năng tái tạo, đặc biệt là trong trường hợp thể tích phản ứng nhỏ. Điều này đòi hỏi các tấm có độ ổn định kích thước đủ để sử dụng trong trạm làm việc. Mã vạch kèm theo cung cấp khả năng đọc máy bổ sung, giúp đơn giản hóa việc theo dõi mẫu trong toàn bộ quá trình.
Lập trình máy luân nhiệt
Việc lập trình một thiết bị có thể tốn thời gian cũng như dễ xảy ra lỗi. Các tính năng khác nhau của máy PCR nhiệt hoạt động cùng nhau để đơn giản hóa bước quy trình này và quan trọng nhất là để đảm bảo an toàn:
Hoạt động dễ dàng và hướng dẫn sử dụng tốt là cơ sở của lập trình hiệu quả. Dựa trên nền tảng này, quản trị người dùng được bảo vệ bằng mật khẩu sẽ ngăn chặn các chương trình của chính người dùng bị người dùng khác thay đổi. Nếu sử dụng nhiều chu kỳ (cùng loại), sẽ có lợi nếu chương trình có thể được chuyển trực tiếp từ thiết bị này sang thiết bị khác qua USB hoặc kết nối. Phần mềm máy tính cho phép quản lý tập trung và an toàn các chương trình, quyền của người dùng và tài liệu trên máy tính.
Chạy PCR
Trong quá trình chạy, DNA được khuếch đại trong bình phản ứng, nơi mỗi mẫu phải được đưa vào các điều kiện phản ứng giống hệt nhau, nhất quán. Các khía cạnh sau đây có liên quan đến quá trình này:
Kiểm soát nhiệt độ
Độ chính xác tuyệt vời trong việc kiểm soát nhiệt độ và tính đồng nhất của khối chu trình là cơ sở để điều hòa nhiệt độ đồng đều của tất cả các mẫu. Chất lượng cao của các thành phần làm nóng và làm mát (các thành phần peltier), cũng như cách chúng được kết nối với khối, là các yếu tố quyết định sẽ xác định nguy cơ chênh lệch nhiệt độ được gọi là "hiệu ứng cạnh"
Bay hơi
Nồng độ của các thành phần phản ứng riêng lẻ không nên thay đổi trong suốt quá trình phản ứng do bay hơi. Nếu không, có thể có rất ítSản phẩm PCRcó thể được tạo ra hoặc không tạo ra gì cả. Do đó, điều quan trọng là phải giảm thiểu sự bay hơi bằng cách đảm bảo một lớp niêm phong an toàn. Trong trường hợp này, nắp được làm nóng của máy tuần hoàn nhiệt và lớp niêm phong của bình hoạt động song song với nhau. Có nhiều tùy chọn niêm phong khác nhau choĐĩa PCR (liên kết: Bài viết về niêm phong), theo đó, độ kín tốt nhất đạt được thông qua quá trình hàn nhiệt. Các loại nắp đậy khác cũng có thể phù hợp, miễn là áp suất tiếp xúc của nắp máy tuần hoàn có thể được điều chỉnh theo độ kín đã chọn.
Chuẩn hóa quy trình được áp dụng để bảo vệ kết quả chính xác và có thể tái tạo trong dài hạn. Điều này bao gồm bảo trì thiết bị thường xuyên để đảm bảo thiết bị luôn hoạt động tốt. Tất cả vật tư tiêu hao phải có chất lượng cao đồng đều trên tất cả các lô sản xuất và phải đảm bảo tính khả dụng đáng tin cậy của chúng.
Thời gian đăng: 29-11-2022