Standardizacija procesa uključuje njihovu optimizaciju te naknadnu uspostavu i harmonizaciju, čime se omogućuje dugoročno optimalno djelovanje – neovisno o korisniku.Standardizacija osigurava visokokvalitetne rezultate, njihovu ponovljivost i usporedivost.
Cilj (klasičnog) PCR-a je generiranje pouzdanog i ponovljivog rezultata.Za određene primjene, prinos odPCR proizvodje također relevantan.Za te reakcije potrebno je paziti da uzorci nisu ugroženi i da tijek PCR rada ostane stabilan.Konkretno, to znači minimiziranje unošenja kontaminacija koje bi mogle dovesti do lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata ili čak inhibirati PCR reakciju.Nadalje, reakcijski uvjeti trebaju biti što je moguće identičniji za svaki pojedinačni uzorak unutar niza i također se mogu prenositi na sljedeće reakcije (iste metode).To se odnosi na sastav reakcija kao i na vrstu kontrole temperature u cikleru.Pogreške korisnika, naravno, treba izbjegavati koliko god je to moguće.
U nastavku ćemo pokazati izazove s kojima se susrećemo tijekom pripreme i tijekom izvođenja PCR-a – i pristupe rješenjima koja postoje u pogledu instrumenata i potrošnog materijala koji se koriste za standardizaciju tijeka rada PCR-a.
Priprema reakcije
Doziranje reakcijskih komponenti u PCR-posude, odnosno ploče, uključuje višestruke izazove koje je potrebno prevladati:
Uvjeti reakcije
Točno i precizno doziranje pojedinačnih komponenti je neophodno kada se žele postići što identičniji reakcijski uvjeti.Osim dobre tehnike pipetiranja, ključan je odabir pravog alata.PCR glavne mješavine često sadrže tvari koje povećavaju viskoznost ili stvaraju pjenu.Tijekom procesa pipetiranja, oni dovode do znatnog vlaženjavrhovi za pipete, čime se smanjuje točnost pipetiranja.Upotreba sustava za izravno doziranje ili alternativnih vrhova za pipete koji su manje skloni vlaženju može poboljšati točnost i preciznost procesa pipetiranja.
Kontaminacije
Tijekom procesa raspršivanja stvaraju se aerosoli koji, ako im se dopusti da dopru do unutrašnjosti pipete, mogu potencijalno kontaminirati drugi uzorak tijekom sljedećeg koraka pipetiranja.To se može spriječiti upotrebom filtarskih vrhova ili sustava izravnog pomaka.
Potrošni materijal kao što susavjeti, posude i ploče koje se koriste u tijeku rada PCR-a ne smiju sadržavati tvari koje kompromitiraju uzorak ili krivotvore rezultat.To uključuje DNA, DNaze, RNaze i PCR inhibitore, kao i komponente koje se potencijalno mogu isprati iz materijala tijekom reakcije – tvari poznate kao tvari koje se mogu isprati.
Korisnička pogreška
Što se više uzoraka obradi, veći je rizik pogreške.Lako se može dogoditi da se uzorak pipetira u krivu posudu ili u krivi bunar.Ovaj rizik se može znatno smanjiti lako uočljivim označavanjem bušotina.Kroz automatizaciju koraka doziranja, "ljudski faktor", tj. pogreške i varijacije povezane s korisnikom, minimiziraju se, čime se povećava ponovljivost, posebno u slučaju malih reakcijskih volumena.To zahtijeva ploče dovoljne dimenzionalne stabilnosti za korištenje u radnoj stanici.Priloženi crtični kodovi pružaju dodatnu strojnu čitljivost, što pojednostavljuje praćenje uzorka tijekom cijelog procesa.
Programiranje termociklera
Programiranje instrumenta može se pokazati dugotrajnim i podložnim pogreškama.Različite značajke PCR termociklera rade zajedno kako bi pojednostavile ovaj korak procesa i, što je najvažnije, učinile ga sigurnim:
Jednostavan rad i dobro korisničko vođenje temelj su učinkovitog programiranja.Gradeći na ovim temeljima, korisnička administracija zaštićena lozinkom spriječit će druge korisnike da mijenjaju vlastite programe.Ako se koristi više ciklera (iste vrste), korisno je ako se program može prenijeti izravno s jednog instrumenta na drugi putem USB-a ili veze.Računalni softver omogućuje centralnu i sigurnu administraciju programa, korisničkih prava i dokumenata na računalu.
PCR izvođenje
Tijekom ciklusa, DNK se umnožava u reakcijskoj posudi, gdje svaki uzorak treba biti podvrgnut identičnim, dosljednim reakcijskim uvjetima.Za proces su relevantni sljedeći aspekti:
Kontrola temperature
Izvrsna točnost u kontroli temperature i homogenost ciklerskog bloka osnova su za ravnomjerno temperaturno kondicioniranje svih uzoraka.Visoka kvaliteta grijaćih i rashladnih elemenata (peltier elementi), kao i način na koji su oni spojeni na blok, odlučujući su čimbenici koji će odrediti rizik od temperaturnih odstupanja poznatih kao "efekt ruba"
Isparavanje
Koncentracije pojedinačnih komponenti reakcije ne bi se trebale mijenjati tijekom reakcije zbog isparavanja.Inače, moguće je da vrlo maloPCR proizvodmogu se generirati ili uopće ne stvaraju.Stoga je ključno smanjiti isparavanje osiguravanjem sigurnog brtvljenja.U ovom slučaju, grijani poklopac termociklera i brtva posude rade ruku pod ruku.Dostupne su različite mogućnosti brtvljenjaPCR ploče (link: Članak o pečaćenju), pri čemu se najbolje brtvljenje postiže toplinskim varenjem.Drugi zatvarači također mogu biti prikladni, sve dok se kontaktni pritisak poklopca ciklika može prilagoditi odabranoj brtvi.
Uspostavljena je standardizacija procesa kako bi se dugoročno osigurali točni i ponovljivi rezultati.To uključuje redovito održavanje opreme kako bi se osiguralo da je uvijek u dobrom radnom stanju.Svi potrošni materijali trebaju biti dosljedno visoke kvalitete u svim proizvedenim serijama, a njihova pouzdana dostupnost mora biti zajamčena.
Vrijeme objave: 29. studenog 2022