يتضمن توحيد العمليات تحسينها ثم تأسيسها ومواءمتها لاحقًا، مما يتيح الأداء الأمثل على المدى الطويل - بغض النظر عن المستخدم.ويضمن التوحيد نتائج عالية الجودة، فضلاً عن إمكانية تكرارها وقابليتها للمقارنة.
الهدف من تفاعل البوليميراز المتسلسل (الكلاسيكي) هو توليد نتيجة موثوقة وقابلة للتكرار.بالنسبة لبعض التطبيقات، فإن العائد منمنتج PCRذو صلة أيضًا.بالنسبة لهذه التفاعلات، يجب توخي الحذر لضمان عدم تعرض العينات للخطر وأن سير عمل PCR يظل مستقرًا.على وجه التحديد، يُترجم هذا إلى تقليل إدخال الملوثات التي قد تؤدي إلى نتائج إيجابية أو سلبية كاذبة أو حتى تمنع تفاعل PCR.علاوة على ذلك، يجب أن تكون ظروف التفاعل متطابقة قدر الإمكان لكل عينة فردية ضمن التشغيل، كما يجب أن تكون قابلة للتحويل إلى التفاعلات اللاحقة (بنفس الطريقة).يشير هذا إلى تكوين التفاعلات وكذلك إلى نوع التحكم في درجة الحرارة في التدوير.وبطبيعة الحال، يجب تجنب أخطاء المستخدم قدر الإمكان.
أدناه، سنعرض التحديات التي تمت مواجهتها أثناء الإعداد وطوال تشغيل PCR - وأساليب الحلول الموجودة فيما يتعلق بالأدوات والمواد الاستهلاكية المستخدمة لتوحيد سير عمل PCR.
تحضير رد الفعل
يشتمل توزيع مكونات التفاعل في أوعية أو لوحات PCR، على التوالي، على تحديات متعددة يجب التغلب عليها:
ظروف رد الفعل
لا غنى عن الجرعات الدقيقة والدقيقة للمكونات الفردية عند استهداف ظروف التفاعل الأكثر تطابقًا قدر الإمكان.بالإضافة إلى تقنية السحب الجيدة، يعد اختيار الأداة المناسبة أمرًا بالغ الأهمية.تحتوي الخلطات الرئيسية لتفاعل البوليميراز المتسلسل في كثير من الأحيان على مواد تزيد من اللزوجة أو تولد الرغوة.أثناء عملية بيبيتينج، تؤدي هذه إلى ترطيب كبير للنصائح ماصة، مما يقلل من دقة الأنابيب.يمكن أن يؤدي استخدام أنظمة التوزيع المباشر أو أطراف الماصات البديلة الأقل عرضة للتبلل إلى تحسين دقة عملية سحب العينة وإحكامها.
الملوثات
أثناء عملية التوزيع، يتم إنشاء الهباء الجوي الذي، إذا سمح له بالوصول إلى داخل الماصة، فمن المحتمل أن يلوث عينة أخرى أثناء خطوة سحب العينة التالية.يمكن منع ذلك باستخدام أطراف التصفية أو أنظمة الإزاحة المباشرة.
المواد الاستهلاكية مثلنصائحيجب ألا تحتوي الأوعية والألواح المستخدمة في سير عمل PCR على مواد تؤثر على العينة أو تزيف النتيجة.وتشمل هذه الحمض النووي، وDNases، وRNases، ومثبطات PCR، بالإضافة إلى المكونات التي من المحتمل أن تتسرب من المادة أثناء التفاعل - المواد المعروفة باسم المواد القابلة للترشيح.
خطأ المستخدم
كلما زاد عدد العينات التي تتم معالجتها، زاد خطر الخطأ.من الممكن أن يحدث بسهولة أن يتم إدخال العينة بالماصة في الوعاء الخطأ أو البئر الخطأ.ويمكن تقليل هذا الخطر إلى حد كبير عن طريق وضع علامات على الآبار يمكن تمييزها بسهولة.من خلال أتمتة خطوات التوزيع، يتم تقليل "العامل البشري"، أي الأخطاء والاختلافات المتعلقة بالمستخدم، وبالتالي زيادة إمكانية التكرار، خاصة في حالة أحجام التفاعل الصغيرة.وهذا يتطلب استخدام لوحات ذات ثبات أبعاد كافٍ في محطة العمل.توفر الرموز الشريطية المرفقة إمكانية قراءة إضافية للآلة، مما يبسط تتبع العينة طوال العملية بأكملها.
برمجة التدوير الحراري
يمكن أن تكون برمجة أداة ما مضيعة للوقت، كما أنها عرضة للخطأ.تعمل ميزات دورة PCR الحرارية المختلفة معًا لتبسيط خطوة العملية هذه، والأهم من ذلك، لجعلها آمنة:
التشغيل السهل وتوجيهات المستخدم الجيدة هي أساس البرمجة الفعالة.وبناءً على هذا الأساس، فإن إدارة المستخدم المحمية بكلمة مرور ستمنع البرامج الخاصة بالشخص من التغيير من قبل مستخدمين آخرين.في حالة استخدام عدة دورات (من نفس النوع)، فمن المفيد أن يتم نقل البرنامج مباشرة من جهاز إلى آخر عبر USB أو الاتصال.تتيح برامج الكمبيوتر الإدارة المركزية والآمنة للبرامج وحقوق المستخدم والمستندات على جهاز الكمبيوتر.
تشغيل PCR
أثناء التشغيل، يتم تضخيم الحمض النووي في وعاء التفاعل، حيث يجب أن تخضع كل عينة لظروف تفاعل متطابقة ومتسقة.الجوانب التالية ذات صلة بالعملية:
التحكم في درجة الحرارة
تعد الدقة الممتازة في التحكم في درجة الحرارة وتجانس كتلة التدوير أساسًا لتكييف درجة الحرارة لجميع العينات.إن الجودة العالية لعناصر التسخين والتبريد (عناصر بلتيير)، وكذلك الطريقة التي يتم بها توصيلها بالكتلة، هي العوامل الحاسمة التي ستحدد خطر الاختلافات في درجات الحرارة المعروفة باسم "تأثير الحافة".
تبخر
يجب ألا تتغير تركيزات مكونات التفاعل الفردية على مدار التفاعل بسبب التبخر.خلاف ذلك، فمن الممكن أن القليل جدامنتج PCRقد يتم إنشاؤها، أو لا شيء على الإطلاق.لذلك من الضروري تقليل التبخر عن طريق ضمان الختم الآمن.في هذه الحالة، يعمل الغطاء الساخن للدراجة الحرارية وختم الوعاء جنبًا إلى جنب.تتوفر خيارات ختم مختلفة للوحات PCR (الرابط: مقالة الختم)، حيث يتم تحقيق أفضل ختم من خلال الختم الحراري.قد تكون عمليات الإغلاق الأخرى مناسبة أيضًا، طالما يمكن ضبط ضغط التلامس الخاص بغطاء التدوير على الختم المحدد.
يتم توحيد العمليات من أجل الحفاظ على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار على المدى الطويل.ويشمل ذلك الصيانة الدورية للمعدات للتأكد من أنها في حالة عمل جيدة دائمًا.يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية ذات جودة عالية باستمرار في جميع الدفعات المنتجة، ويجب ضمان توفرها بشكل موثوق.
وقت النشر: 29 نوفمبر 2022