การกำหนดมาตรฐานของกระบวนการรวมถึงการเพิ่มประสิทธิภาพและการสร้างและการประสานกันในภายหลัง ซึ่งช่วยให้เกิดประสิทธิภาพสูงสุดในระยะยาว โดยเป็นอิสระจากผู้ใช้การกำหนดมาตรฐานทำให้มั่นใจได้ถึงผลลัพธ์คุณภาพสูง รวมถึงความสามารถในการทำซ้ำและการเปรียบเทียบได้
เป้าหมายของ PCR (แบบคลาสสิก) คือการสร้างผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้สำหรับการใช้งานบางประเภทจะได้ผลผลิตของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ก็มีความเกี่ยวข้องเช่นกันสำหรับปฏิกิริยาเหล่านี้ ต้องใช้ความระมัดระวังเพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างจะไม่ได้รับผลกระทบ และขั้นตอนการทำงานของ PCR ยังคงมีเสถียรภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่ง สิ่งนี้แปลว่าเป็นการลดการปนเปื้อนที่อาจนำไปสู่ผลบวกลวงหรือผลลบลวง หรือแม้แต่ยับยั้งปฏิกิริยา PCRนอกจากนี้ สภาวะของปฏิกิริยาควรเหมือนกันที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้สำหรับตัวอย่างแต่ละตัวอย่างภายในการทดสอบและสามารถถ่ายโอนไปยังปฏิกิริยาที่ตามมาได้ (ของวิธีการเดียวกัน)นี่หมายถึงองค์ประกอบของปฏิกิริยาตลอดจนประเภทของการควบคุมอุณหภูมิในตัวปั่นจักรยานแน่นอนว่าข้อผิดพลาดของผู้ใช้จะต้องหลีกเลี่ยงให้ได้มากที่สุด
ด้านล่างนี้ เราจะสาธิตความท้าทายที่พบในระหว่างการเตรียมการและตลอดการทำงานของ PCR และวิธีการแก้ไขปัญหาที่มีอยู่ที่เกี่ยวข้องกับเครื่องมือและวัสดุสิ้นเปลืองที่ใช้ในการสร้างมาตรฐานของขั้นตอนการทำงาน PCR
การเตรียมปฏิกิริยา
การจ่ายส่วนประกอบของปฏิกิริยาลงในภาชนะ PCR หรือเพลต ตามลำดับ ประกอบด้วยความท้าทายหลายประการที่ต้องเอาชนะ:
สภาวะของปฏิกิริยา
การจ่ายส่วนประกอบแต่ละส่วนที่แม่นยำและแม่นยำเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้เมื่อมุ่งเป้าไปที่สภาวะปฏิกิริยาที่เหมือนกันมากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้นอกจากเทคนิคการปิเปตที่ดีแล้ว การเลือกเครื่องมือที่เหมาะสมยังเป็นสิ่งสำคัญอีกด้วยส่วนผสมหลักของ PCR มักประกอบด้วยสารที่เพิ่มความหนืดหรือทำให้เกิดฟองในระหว่างกระบวนการปิเปต สิ่งเหล่านี้ทำให้เปียกอย่างมากเคล็ดลับปิเปตจึงทำให้ความแม่นยำในการปิเปตลดลงการใช้ระบบการจ่ายโดยตรงหรือทิปปิเปตทางเลือกที่มีโอกาสน้อยที่จะทำให้เปียกสามารถปรับปรุงความแม่นยำและความแม่นยำของกระบวนการปิเปตได้
การปนเปื้อน
ในระหว่างกระบวนการจ่าย ละอองลอยจะถูกสร้างขึ้นซึ่งหากปล่อยให้เข้าถึงด้านในของปิเปต ก็อาจทำให้ตัวอย่างอื่นปนเปื้อนในขั้นตอนการปิเปตถัดไปได้ซึ่งสามารถป้องกันได้โดยใช้ปลายตัวกรองหรือระบบการเคลื่อนที่โดยตรง
ของใช้สิ้นเปลือง เช่นเคล็ดลับภาชนะและเพลตที่ใช้ในขั้นตอนการทำงาน PCR จะต้องไม่มีสารที่ทำให้ตัวอย่างเสียหายหรือทำให้ผลลัพธ์เป็นเท็จซึ่งรวมถึง DNA, DNases, RNases และสารยับยั้ง PCR รวมถึงส่วนประกอบที่อาจชะออกจากวัสดุในระหว่างการทำปฏิกิริยา ซึ่งเป็นสารที่เรียกว่าสารที่สามารถชะล้างได้
ข้อผิดพลาดของผู้ใช้
ยิ่งมีการประมวลผลตัวอย่างมากเท่าใด ความเสี่ยงต่อข้อผิดพลาดก็จะยิ่งมากขึ้นเท่านั้นอาจเกิดขึ้นได้ง่ายๆ ที่มีการปิเปตตัวอย่างลงในภาชนะผิดหรือผิดหลุมความเสี่ยงนี้สามารถลดลงได้อย่างมากด้วยการทำเครื่องหมายหลุมที่มองเห็นได้ง่ายขั้นตอนการจ่ายแบบอัตโนมัติ "ปัจจัยมนุษย์" เช่น ข้อผิดพลาดและความผันแปรที่เกี่ยวข้องกับผู้ใช้ จะลดลง จึงเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่มีปริมาณปฏิกิริยาน้อยซึ่งต้องใช้เพลตที่มีมิติความเสถียรเพียงพอจึงจะถูกนำมาใช้ในเวิร์กสเตชันบาร์โค้ดที่แนบมาช่วยให้เครื่องอ่านได้ง่ายขึ้น ซึ่งช่วยให้การติดตามตัวอย่างตลอดทั้งกระบวนการง่ายขึ้น
การเขียนโปรแกรมเทอร์โมไซเคิล
การเขียนโปรแกรมเครื่องมือสามารถพิสูจน์ได้ว่าใช้เวลานานและเกิดข้อผิดพลาดได้ง่ายคุณสมบัติต่างๆ ของ PCR Thermal Cycler ทำงานร่วมกันเพื่อลดความซับซ้อนของขั้นตอนกระบวนการนี้ และที่สำคัญที่สุดคือทำให้ปลอดภัย:
การใช้งานง่ายและคำแนะนำผู้ใช้ที่ดีเป็นพื้นฐานของการเขียนโปรแกรมที่มีประสิทธิภาพจากรากฐานนี้ การดูแลระบบผู้ใช้ที่มีการป้องกันด้วยรหัสผ่านจะป้องกันไม่ให้โปรแกรมของตัวเองถูกแก้ไขโดยผู้ใช้รายอื่นหากมีการใช้งานโปรแกรมไซเคิลหลายตัว (ประเภทเดียวกัน) จะเป็นประโยชน์หากโปรแกรมสามารถถ่ายโอนจากอุปกรณ์เครื่องหนึ่งไปยังอีกเครื่องหนึ่งได้โดยตรงผ่าน USB หรือการเชื่อมต่อซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์ช่วยให้สามารถบริหารจัดการโปรแกรม สิทธิ์ผู้ใช้ และเอกสารบนคอมพิวเตอร์ได้จากส่วนกลางและปลอดภัย
การทำงานของ PCR
ในระหว่างการดำเนินการ DNA จะถูกขยายในถังปฏิกิริยา ซึ่งแต่ละตัวอย่างควรอยู่ภายใต้สภาวะของปฏิกิริยาที่เหมือนกันและสม่ำเสมอด้านต่อไปนี้เกี่ยวข้องกับกระบวนการ:
การควบคุมอุณหภูมิ
ความแม่นยำที่ยอดเยี่ยมในการควบคุมอุณหภูมิและความสม่ำเสมอของบล็อกตัวหมุนเป็นพื้นฐานสำหรับการปรับอุณหภูมิที่สม่ำเสมอของตัวอย่างทั้งหมดคุณภาพสูงขององค์ประกอบความร้อนและความเย็น (องค์ประกอบ Peltier) ตลอดจนวิธีที่เชื่อมต่อสิ่งเหล่านี้เข้ากับบล็อก เป็นปัจจัยในการตัดสินใจซึ่งจะกำหนดความเสี่ยงของความคลาดเคลื่อนของอุณหภูมิที่เรียกว่า "เอฟเฟกต์ขอบ"
การระเหย
ความเข้มข้นของส่วนประกอบปฏิกิริยาแต่ละรายการไม่ควรเปลี่ยนแปลงตลอดระยะเวลาของปฏิกิริยาเนื่องจากการระเหยไม่เช่นนั้นก็เป็นไปได้น้อยมากผลิตภัณฑ์พีซีอาร์อาจจะเกิดขึ้นหรือไม่มีเลยก็ได้ดังนั้นจึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องลดการระเหยให้เหลือน้อยที่สุดโดยรับประกันการปิดผนึกที่ปลอดภัยในกรณีนี้ ฝาอุ่นของเทอร์โมไซเคิลและซีลของถังจะทำงานประสานกันมีตัวเลือกการปิดผนึกที่แตกต่างกันสำหรับเพลต PCR (ลิงก์: บทความเกี่ยวกับการซีล)โดยที่การปิดผนึกที่ดีที่สุดทำได้โดยการปิดผนึกด้วยความร้อนการปิดแบบอื่นๆ อาจเหมาะสมเช่นกัน ตราบใดที่แรงกดสัมผัสของฝาจักรยานสามารถปรับได้กับซีลที่เลือก
มีการกำหนดมาตรฐานกระบวนการเพื่อปกป้องผลลัพธ์ที่แม่นยำและทำซ้ำได้ในระยะยาวรวมถึงการบำรุงรักษาอุปกรณ์อย่างสม่ำเสมอเพื่อให้แน่ใจว่าอุปกรณ์อยู่ในสภาพการทำงานที่ดีอยู่เสมอวัสดุสิ้นเปลืองทั้งหมดควรมีคุณภาพสูงอย่างสม่ำเสมอในทุกล็อตที่ผลิต และต้องรับประกันความพร้อมใช้งานที่เชื่อถือได้
เวลาโพสต์: 29 พ.ย.-2022