プロセスの標準化にはプロセスの最適化とその後の確立と調和が含まれており、ユーザーに依存せずに長期的に最適なパフォーマンスを実現します。標準化により、高品質の結果だけでなく、その再現性や比較可能性も確保されます。
(古典的な) PCR の目標は、信頼性と再現性のある結果を生成することです。特定の用途では、PCR産物も関連します。これらの反応では、サンプルが損なわれず、PCR ワークフローが安定した状態に保たれるように注意する必要があります。具体的には、これは、偽陽性または偽陰性の結果をもたらしたり、PCR 反応を阻害したりする可能性のある汚染物質の導入を最小限に抑えることを意味します。さらに、反応条件は、実行内の個々のサンプルごとにできる限り同一である必要があり、また、(同じメソッドの) 後続の反応にも移行可能である必要があります。これは、反応の組成とサイクラー内の温度制御のタイプを指します。もちろん、ユーザーのエラーは可能な限り回避する必要があります。
以下では、PCR の準備中および実行中に遭遇する課題と、PCR ワークフローの標準化に使用される機器および消耗品に関して存在する解決策へのアプローチを示します。
反応の準備
反応成分を PCR 容器またはプレートに分注する際には、克服しなければならない複数の課題が含まれます。
反応条件
可能な限り同一の反応条件を目指す場合、個々の成分を正確かつ正確に投与することが不可欠です。優れたピペッティング技術に加えて、適切なツールを選択することが重要です。PCR マスターミックスには、粘度を高めたり、泡を発生させたりする物質が含まれることがよくあります。ピペット操作プロセス中に、これらにより、ボトルが大幅に濡れます。ピペットチップそのため、ピペッティングの精度が低下します。直接分注システムまたは濡れにくい代替ピペット チップを使用すると、ピペッティング プロセスの精度と精度を向上させることができます。
汚染
分注プロセス中にエアロゾルが生成され、ピペットの内部に到達すると、次のピペット操作ステップで別のサンプルを汚染する可能性があります。これは、フィルターチップまたは直接置換システムを使用することで防止できます。
などの消耗品チップ、PCR ワークフローで使用される容器およびプレートには、サンプルを損傷したり結果を改ざんしたりする物質が含まれていてはなりません。これらには、DNA、DNase、RNase、PCR 阻害剤のほか、反応中に材料から浸出する可能性のある成分 (浸出物として知られる物質) が含まれます。
ユーザーエラー
処理されるサンプルが増えるほど、エラーのリスクが高くなります。サンプルが間違った容器または間違ったウェルにピペットで移されることが容易に起こります。このリスクは、ウェルに簡単に識別できるマーキングを付けることで大幅に軽減できます。分注ステップの自動化により、「人的要因」、つまりエラーやユーザー関連の変動が最小限に抑えられ、特に反応量が少ない場合の再現性が向上します。このため、ワークステーションで使用するには十分な寸法安定性を備えたプレートが必要です。添付のバーコードにより機械可読性が向上し、プロセス全体を通じてサンプルの追跡が簡素化されます。
サーモサイクラーのプログラミング
機器のプログラミングは時間がかかるだけでなく、エラーも発生しやすいことがわかります。PCR サーマル サイクラーのさまざまな機能が連携してこのプロセス ステップを簡素化し、最も重要なことに安全性を高めます。
簡単な操作と優れたユーザーガイダンスは、効率的なプログラミングの基礎です。この基盤の上に、パスワードで保護されたユーザー管理を構築することで、自分のプログラムが他のユーザーによって変更されるのを防ぎます。複数のサイクラー (同じタイプ) が使用されている場合、USB または接続経由でプログラムを 1 つの機器から別の機器に直接転送できれば有益です。コンピュータ ソフトウェアを使用すると、コンピュータ上のプログラム、ユーザー権利、ドキュメントを一元的かつ安全に管理できます。
PCRの実行
実行中、DNA は反応容器内で増幅されます。各サンプルは同一の一貫した反応条件にさらされる必要があります。このプロセスには次の側面が関係します。
温度管理
優れた温度制御精度とサイクラーブロックの均質性が、すべてのサンプルの均一な温度調整の基礎となります。加熱素子と冷却素子 (ペルチェ素子) の高品質、およびこれらのブロックへの接続方法が、「エッジ効果」として知られる温度不一致のリスクを決定する決定要因となります。
蒸発
個々の反応成分の濃度は、蒸発により反応の過程で変化してはなりません。そうでなければ、非常に少ない可能性がありますPCR産物生成される場合もあれば、まったく生成されない場合もあります。したがって、確実なシールを確保して蒸発を最小限に抑えることが重要です。この場合、サーモサイクラーの加熱された蓋と容器のシールが連携して機能します。さまざまなシーリングオプションが利用可能ですPCRプレート（リンク：シーリング記事）これにより、ヒートシールによって最高のシールが実現されます。サイクラー蓋の接触圧力が選択されたシールに合わせて調整できる限り、他のクロージャも適切である可能性があります。
正確で再現可能な結果を長期的に保護するために、プロセスの標準化が行われています。これには、機器を常に良好な状態に保つための定期的なメンテナンスが含まれます。すべての消耗品は、生産されるすべてのロットにわたって一貫して高品質である必要があり、その信頼性の高い入手可能性が保証されなければなりません。
投稿日時: 2022 年 11 月 29 日