Standardiseringen av processer inkluderar deras optimering och efterföljande etablering och harmonisering, vilket möjliggör långsiktig optimal prestanda – oberoende av användaren.Standardisering säkerställer resultat av hög kvalitet, samt deras reproducerbarhet och jämförbarhet.
Målet med (klassisk) PCR är att skapa ett tillförlitligt och reproducerbart resultat.För vissa tillämpningar, utbytet avPCR-produktär också relevant.För dessa reaktioner måste man se till att proverna inte äventyras och att PCR-arbetsflödet förblir stabilt.Specifikt innebär detta att minimera införandet av föroreningar som kan leda till falskt positiva eller falskt negativa resultat eller till och med hämma PCR-reaktionen.Vidare bör reaktionsbetingelserna vara så identiska som möjligt för varje enskilt prov inom en körning och även kunna överföras till efterföljande reaktioner (med samma metod).Detta avser sammansättningen av reaktionerna såväl som till typen av temperaturkontroll i cyklern.Användarfel ska naturligtvis undvikas så mycket som möjligt.
Nedan kommer vi att visa de utmaningar som uppstår under förberedelserna och under hela körningen av en PCR – och tillvägagångssätten för lösningar som finns med avseende på instrument och förbrukningsvaror som används för standardisering av PCR-arbetsflöden.
Reaktionsberedning
Dispenseringen av reaktionskomponenter i PCR-kärl, respektive plattor, innefattar flera utmaningar som måste övervinnas:
Reaktionsförhållanden
Den exakta och exakta doseringen av de enskilda komponenterna är oumbärlig när man strävar efter så identiska reaktionsförhållanden som möjligt.Förutom en bra pipetteringsteknik är det viktigt att välja rätt verktyg.PCR-mastermixar innehåller ofta ämnen som ökar viskositeten eller genererar skum.Under pipetteringsprocessen leder dessa till betydande vätning avpipettspetsar, vilket minskar pipetteringsnoggrannheten.Användning av direkta dispenseringssystem eller alternativa pipettspetsar som är mindre benägna att väta kan förbättra pipetteringsprocessens noggrannhet och precision.
Föroreningar
Under dispenseringsprocessen genereras aerosoler som, om de tillåts nå insidan av pipetten, potentiellt kan kontaminera ett annat prov under nästa pipeteringssteg.Detta kan förhindras genom att använda filterspetsar eller direktförskjutningssystem.
Förbrukningsmaterial som t.extips, kärl och plattor som används i PCR-arbetsflödet får inte innehålla ämnen som äventyrar provet eller förfalskar resultatet.Dessa inkluderar DNA, DNaser, RNaser och PCR-hämmare, såväl som komponenter som potentiellt kan läcka ut från materialet under reaktionen – ämnen som kallas utlakningsbara.
Användarfel
Ju fler prover som bearbetas, desto högre är felrisken.Det kan lätt hända att ett prov pipetteras i fel kärl eller fel brunn.Denna risk kan reduceras avsevärt genom lätt urskiljbar markering av brunnarna.Genom automatisering av dispenseringsstegen minimeras den "mänskliga faktorn", dvs fel och användarrelaterade variationer, vilket ökar reproducerbarheten, speciellt vid små reaktionsvolymer.Detta kräver att plattor med tillräcklig dimensionsstabilitet kan användas i en arbetsstation.Bifogade streckkoder ger ytterligare maskinläsbarhet, vilket förenklar provspårning genom hela processen.
Programmering av termocyklern
Att programmera ett instrument kan visa sig vara både tidskrävande och felbenäget.Olika PCR termiska cyklerfunktioner arbetar tillsammans för att förenkla detta processsteg och, viktigast av allt, för att göra det säkert:
Enkel hantering och bra användarvägledning är grunden för effektiv programmering.Med utgångspunkt från denna grund kommer lösenordsskyddad användaradministration att förhindra att ens egna program ändras av andra användare.Om flera cykler (av samma typ) används är det fördelaktigt om ett program kan överföras direkt från ett instrument till ett annat via USB eller anslutning.Datorprogram möjliggör central och säker administration av program, användarrättigheter och dokument på en dator.
PCR-körning
Under körningen amplifieras DNA i reaktionskärlet, där varje prov ska utsättas för identiska, konsekventa reaktionsförhållanden.Följande aspekter är relevanta för processen:
Temperaturkontroll
Utmärkt noggrannhet i temperaturkontroll och homogenitet hos cyklerblocket är grunden för jämn temperaturkonditionering av alla prover.Den höga kvaliteten på värme- och kylelementen (peltierelement), liksom sättet på vilket dessa är anslutna till blocket, är de avgörande faktorerna som avgör risken för temperaturavvikelser som kallas "kanteffekten"
avdunstning
Koncentrationerna av de individuella reaktionskomponenterna bör inte ändras under reaktionens gång på grund av avdunstning.Annars är det möjligt att väldigt litePCR-produktkan genereras, eller ingen alls.Det är därför avgörande att minimera avdunstning genom att säkerställa en säker tätning.I det här fallet fungerar termocyklerns uppvärmda lock och kärlets tätning hand i hand.Olika tätningsalternativ finns tillgängliga förPCR-plattor (länk: Förseglingsartikel), varvid den bästa tätningen uppnås genom värmeförsegling.Andra förslutningar kan också vara lämpliga, så länge som kontakttrycket på cyklerlocket kan justeras till den valda tätningen.
Processstandardisering är på plats för att säkerställa korrekta och reproducerbara resultat på lång sikt.Detta inkluderar regelbundet underhåll av utrustningen för att säkerställa att den alltid är i gott skick.Alla förbrukningsvaror bör vara av konsekvent hög kvalitet för alla producerade partier, och deras tillförlitliga tillgänglighet måste garanteras.
Posttid: 2022-nov-29