Standardiseringen af processer omfatter deres optimering og efterfølgende etablering og harmonisering, hvilket muliggør langsigtet optimal ydeevne – uafhængig af brugeren.Standardisering sikrer resultater af høj kvalitet samt deres reproducerbarhed og sammenlignelighed.
Målet med (klassisk) PCR er at skabe et pålideligt og reproducerbart resultat.For visse anvendelser er udbyttet afPCR produkter også relevant.For disse reaktioner skal man sørge for, at prøverne ikke kompromitteres, og at PCR-arbejdsgangen forbliver stabil.Specifikt oversættes dette til at minimere introduktionen af forurening, der kan føre til falsk positive eller falsk negative resultater eller endda hæmme PCR-reaktionen.Endvidere skal reaktionsbetingelserne være så identiske som muligt for hver enkelt prøve inden for en kørsel og også kunne overføres til efterfølgende reaktioner (af samme metode).Dette refererer til sammensætningen af reaktionerne såvel som til typen af temperaturkontrol i cycler.Brugerfejl skal selvfølgelig så vidt muligt undgås.
Nedenfor vil vi demonstrere de udfordringer, der opstår under forberedelse og gennem hele forløbet af en PCR – og de tilgange til løsninger, der findes med hensyn til instrumenter og forbrugsstoffer, der bruges til standardisering af PCR-arbejdsgangene.
Reaktionsforberedelse
Dispenseringen af reaktionskomponenter i henholdsvis PCR-beholdere eller plader omfatter flere udfordringer, som skal overvindes:
Reaktionsbetingelser
Den nøjagtige og præcise dosering af de enkelte komponenter er uundværlig, når man tilstræber de mest identiske reaktionsbetingelser som muligt.Ud over en god pipetteringsteknik er det afgørende at vælge det rigtige værktøj.PCR-masterblandinger indeholder ofte stoffer, som øger viskositeten eller danner skum.Under pipetteringsprocessen fører disse til betydelig befugtning afpipettespidser, hvilket reducerer pipetteringsnøjagtigheden.Brugen af direkte dispenseringssystemer eller alternative pipettespidser, der er mindre tilbøjelige til at blive befugtet, kan forbedre nøjagtigheden og præcisionen af pipetteringsprocessen.
Forurening
Under dispenseringsprocessen dannes der aerosoler, som, hvis de får lov til at nå indersiden af pipetten, potentielt kan forurene en anden prøve under det næste pipeteringstrin.Dette kan forhindres ved at bruge filterspidser eller direkte forskydningssystemer.
Forbrugsstoffer som f.eksTips, må beholdere og plader, der anvendes i PCR-arbejdsgangen, ikke indeholde stoffer, som kompromitterer prøven eller forfalsker resultatet.Disse omfatter DNA, DNaser, RNaser og PCR-hæmmere samt komponenter, der potentielt kan udvaskes fra materialet under reaktionen - stoffer kendt som udvaskbare.
Brugerfejl
Jo flere prøver der behandles, jo højere er fejlrisikoen.Det kan nemt ske, at en prøve pipetteres i den forkerte beholder eller den forkerte brønd.Denne risiko kan reduceres betydeligt ved let synlig markering af brøndene.Gennem automatisering af dispenseringstrin minimeres den "menneskelige faktor", dvs. fejl og brugerrelaterede variationer, hvilket øger reproducerbarheden, især ved små reaktionsvolumener.Dette kræver, at plader med tilstrækkelig dimensionsstabilitet kan anvendes i en arbejdsstation.Vedhæftede stregkoder giver ekstra maskinlæsbarhed, hvilket forenkler prøvesporing gennem hele processen.
Programmering af termocykleren
Programmering af et instrument kan vise sig at være tidskrævende såvel som fejludsat.Forskellige PCR termiske cyklerfunktioner arbejder sammen for at forenkle dette procestrin og, vigtigst af alt, for at gøre det sikkert:
Nem betjening og god brugervejledning er grundlaget for effektiv programmering.Med udgangspunkt i dette fundament vil adgangskodebeskyttet brugeradministration forhindre ens egne programmer i at blive ændret af andre brugere.Hvis flere cyklere (af samme type) er i brug, er det en fordel, hvis et program kan overføres direkte fra et instrument til et andet via USB eller tilslutning.Computersoftware muliggør central og sikker administration af programmer, brugerrettigheder og dokumenter på en computer.
PCR kørsel
Under kørslen amplificeres DNA i reaktionsbeholderen, hvor hver prøve skal udsættes for identiske, ensartede reaktionsbetingelser.Følgende aspekter er relevante for processen:
Temperaturkontrol
Fremragende nøjagtighed i temperaturkontrol og homogenitet af cyklerblokken er grundlaget for jævn temperaturkonditionering af alle prøver.Den høje kvalitet af varme- og køleelementerne (peltier-elementer) samt måden, hvorpå disse er forbundet med blokken, er de afgørende faktorer, som vil bestemme risikoen for temperaturforskelle kendt som "kanteffekten"
Fordampning
Koncentrationerne af de enkelte reaktionskomponenter bør ikke ændre sig i løbet af reaktionen på grund af fordampning.Ellers er det muligt, at meget lidtPCR produktkan være genereret, eller slet ingen.Det er derfor afgørende at minimere fordampning ved at sikre en sikker tætning.I dette tilfælde arbejder termocyklerens opvarmede låg og beholderens forsegling hånd i hånd.Forskellige tætningsmuligheder er tilgængelige forPCR-plader (link: Forseglingsartikel), hvorved den bedste tætning opnås gennem varmeforsegling.Andre lukninger kan også være egnede, så længe kontakttrykket på cyklerlåget kan justeres til den valgte tætning.
Processtandardisering er på plads for at sikre nøjagtige og reproducerbare resultater på lang sigt.Dette omfatter regelmæssig vedligeholdelse af udstyret for at sikre, at det altid er i god stand.Alle forbrugsvarer skal være af konsekvent høj kvalitet på tværs af alle producerede partier, og deres pålidelige tilgængelighed skal garanteres.
Indlægstid: 29. november 2022