Kasama sa standardisasyon ng mga proseso ang kanilang pag-optimize at kasunod na pagtatatag at pagkakatugma, na nagbibigay-daan sa pangmatagalang pinakamainam na pagganap - independyente sa gumagamit.Tinitiyak ng standardization ang mataas na kalidad na mga resulta, pati na rin ang kanilang reproducibility at comparability.
Ang layunin ng (klasikong) PCR ay ang pagbuo ng isang maaasahan at maaaring kopyahin na resulta.Para sa ilang mga aplikasyon, ang ani ngprodukto ng PCRay may kaugnayan din.Para sa mga reaksyong ito, kailangang mag-ingat upang matiyak na ang mga sample ay hindi nakompromiso at ang PCR workflow ay nananatiling stable.Sa partikular, ito ay nangangahulugan ng pagliit sa pagpapakilala ng mga kontaminasyon na maaaring humantong sa maling positibo o maling negatibong mga resulta o kahit na pumipigil sa reaksyon ng PCR.Higit pa rito, ang mga kondisyon ng reaksyon ay dapat na magkapareho hangga't maaari para sa bawat indibidwal na sample sa loob ng isang run at maililipat din sa mga kasunod na reaksyon (ng parehong paraan).Ito ay tumutukoy sa komposisyon ng mga reaksyon gayundin sa uri ng temperatura control sa cycler.Ang mga pagkakamali ng gumagamit, siyempre, ay dapat iwasan hangga't maaari.
Sa ibaba, ipapakita namin ang mga hamon na nararanasan sa panahon ng paghahanda at sa buong pagpapatakbo ng isang PCR – at ang mga diskarte sa mga solusyon na umiiral kaugnay ng mga instrumento at mga consumable na ginagamit para sa standardisasyon ng mga workflow ng PCR.
Paghahanda ng reaksyon
Ang dispensing ng mga bahagi ng reaksyon sa mga PCR-vessel, o mga plato, ayon sa pagkakabanggit, ay binubuo ng maraming hamon na dapat malampasan:
Mga kondisyon ng reaksyon
Ang eksaktong at tumpak na dosing ng mga indibidwal na sangkap ay kailangang-kailangan kapag naglalayon para sa pinaka magkaparehong mga kondisyon ng reaksyon na posible.Bilang karagdagan sa isang mahusay na pamamaraan ng pipetting, ang pagpili ng tamang tool ay kritikal.Ang PCR master-mixes ay madalas na naglalaman ng mga substance na nagpapataas ng lagkit o bumubuo ng foam.Sa panahon ng proseso ng pipetting, ang mga ito ay humahantong sa malaking basa ngmga tip sa pipette, kaya binabawasan ang katumpakan ng pipetting.Ang paggamit ng mga direct dispensing system o alternatibong pipette tip na hindi gaanong madaling mabasa ay maaaring mapabuti ang katumpakan at katumpakan ng proseso ng pipetting.
Mga kontaminasyon
Sa panahon ng proseso ng dispensing, nabubuo ang mga aerosol na, kung papayagang maabot ang loob ng pipette, ay posibleng makahawa ng isa pang sample sa susunod na hakbang sa pipetting.Maiiwasan ito sa pamamagitan ng paggamit ng mga tip sa filter o mga direktang sistema ng pag-aalis.
Mga consumable tulad ngmga tip, mga sisidlan at mga plato na ginagamit sa daloy ng trabaho ng PCR ay hindi dapat maglaman ng mga sangkap na nakakakompromiso sa sample o napeke ang resulta.Kabilang dito ang mga DNA, DNases, RNases at PCR inhibitors, pati na rin ang mga bahagi na posibleng ma-leach mula sa materyal sa panahon ng reaksyon – mga substance na kilala bilang mga leachable.
Error ng user
Kung mas maraming sample ang naproseso, mas mataas ang panganib ng error.Madaling mangyari na ang isang sample ay na-pipette sa maling sisidlan o sa maling balon.Ang panganib na ito ay maaaring mabawasan nang malaki sa pamamagitan ng madaling makitang pagmamarka ng mga balon.Sa pamamagitan ng pag-automate ng mga hakbang sa pagbibigay, ang "human factor", ibig sabihin, ang mga error at mga pagkakaiba-iba na nauugnay sa gumagamit, ay pinaliit, kaya nadaragdagan ang muling paggawa, lalo na sa kaso ng maliit na dami ng reaksyon.Nangangailangan ito ng mga plate na may sapat na dimensional na katatagan upang magamit sa isang workstation.Ang mga naka-attach na barcode ay nagbibigay ng karagdagang machine-readability, na pinapasimple ang sample tracking sa buong proseso.
Programming ng thermocycler
Ang pag-program ng isang instrumento ay maaaring mapatunayang nakakaubos ng oras at madaling magkaroon ng error.Nagtutulungan ang iba't ibang feature ng PCR thermal cycler para pasimplehin ang prosesong ito at, higit sa lahat, para gawin itong ligtas:
Ang madaling operasyon at mahusay na gabay ng gumagamit ay ang batayan ng mahusay na programming.Batay sa pundasyong ito, pipigilan ng pangangasiwa ng user na protektado ng password ang sariling mga programa na mabago ng ibang mga user.Kung maraming cyclers (ng parehong uri) ang ginagamit, ito ay kapaki-pakinabang kung ang isang programa ay maaaring direktang ilipat mula sa isang instrumento patungo sa isa pa sa pamamagitan ng USB o koneksyon.Ang computer software ay nagbibigay-daan sa sentral at secure na pangangasiwa ng mga program, karapatan ng user at mga dokumento sa isang computer.
PCR run
Sa panahon ng pagtakbo, ang DNA ay pinalaki sa daluyan ng reaksyon, kung saan ang bawat sample ay dapat sumailalim sa magkapareho, pare-parehong mga kondisyon ng reaksyon.Ang mga sumusunod na aspeto ay may kaugnayan para sa proseso:
Pagkontrol sa temperatura
Napakahusay na katumpakan sa kontrol ng temperatura at homogeneity ng bloke ng cycler ay ang batayan para sa pantay na pagkondisyon ng temperatura ng lahat ng mga sample.Ang mataas na kalidad ng mga heating at cooling elements (peltier elements), pati na rin ang paraan kung saan ang mga ito ay konektado sa block, ay ang mga mapagpasyang salik na tutukuyin ang panganib ng mga pagkakaiba sa temperatura na kilala bilang "edge effect"
Pagsingaw
Ang mga konsentrasyon ng mga indibidwal na sangkap ng reaksyon ay hindi dapat magbago sa kurso ng reaksyon dahil sa pagsingaw.Kung hindi, ito ay posible na napakaliitprodukto ng PCRmaaaring mabuo, o wala man lang.Samakatuwid, napakahalaga na mabawasan ang pagsingaw sa pamamagitan ng pagtiyak ng isang secure na selyo.Sa kasong ito, ang pinainit na takip ng thermocycler at ang selyo ng sisidlan ay gumagana nang magkahawak-kamay.Iba't ibang opsyon sa sealing ang magagamit para saMga PCR plate (link: Artikulo ng selyadong), kung saan ang pinakamahusay na selyo ay nakakamit sa pamamagitan ng heat sealing.Ang iba pang mga pagsasara ay maaari ding maging angkop, hangga't ang contact pressure ng cycler lid ay maaaring iakma sa napiling selyo.
Ang standardisasyon ng proseso ay inilalagay upang mapangalagaan ang tumpak at maaaring kopyahin na mga resulta sa mahabang panahon.Kabilang dito ang regular na pagpapanatili ng kagamitan upang matiyak na ito ay palaging nasa mabuting kondisyon sa pagtatrabaho.Ang lahat ng mga consumable ay dapat na palaging may mataas na kalidad sa lahat ng mga lot na ginawa, at ang kanilang maaasahang availability ay dapat na garantisadong.
Oras ng post: Nob-29-2022