Стандартизація процесів включає їх оптимізацію та подальше встановлення та гармонізацію, що забезпечує довгострокову оптимальну продуктивність – незалежно від користувача.Стандартизація забезпечує високу якість результатів, а також їх відтворюваність і порівнянність.
Метою (класичної) ПЛР є отримання надійного та відтворюваного результату.Для певних застосувань вихід вПродукт ПЛРтакож є актуальним.Для цих реакцій необхідно подбати про те, щоб зразки не були скомпрометовані та щоб робочий процес ПЛР залишався стабільним.Зокрема, це означає мінімізацію введення забруднень, які можуть призвести до хибнопозитивних або хибнонегативних результатів або навіть пригнічення реакції ПЛР.Крім того, умови реакції повинні бути якомога ідентичнішими для кожного окремого зразка в серії, а також бути придатними для подальших реакцій (того самого методу).Це стосується складу реакцій, а також типу контролю температури в циклері.Звичайно, слід уникати помилок користувача, наскільки це можливо.
Нижче ми продемонструємо труднощі, з якими стикаємося під час підготовки та під час проведення ПЛР, а також підходи до рішень, які існують щодо інструментів і витратних матеріалів, що використовуються для стандартизації робочих процесів ПЛР.
Підготовка реакції
Дозування реакційних компонентів у ПЛР-судини, або планшети, відповідно, складається з кількох проблем, які необхідно подолати:
Умови реакції
Точне та точне дозування окремих компонентів є необхідним, коли прагнете до максимально ідентичних умов реакції.Окрім гарної техніки піпетування, вирішальним є вибір правильного інструменту.Основні суміші для ПЛР часто містять речовини, які підвищують в’язкість або утворюють піну.Під час процесу піпетування це призводить до значного змочуваннянаконечники піпеток, таким чином знижуючи точність дозування.Використання систем прямого дозування або альтернативних наконечників піпеток, які менш схильні до зволоження, може підвищити точність процесу дозування.
Забруднення
Під час процесу дозування утворюються аерозолі, які, якщо потрапити всередину піпетки, можуть потенційно забруднити інший зразок під час наступного етапу дозування.Цьому можна запобігти, використовуючи наконечники фільтрів або системи прямого витіснення.
Витратні матеріали, такі якпоради, посудини та пластини, які використовуються в робочому процесі ПЛР, не повинні містити речовин, які скомпрометують зразок або фальсифікують результат.До них відносяться ДНК, ДНКази, РНКази та інгібітори ПЛР, а також компоненти, які потенційно можуть вимиватися з матеріалу під час реакції – речовини, відомі як речовини, що вимиваються.
Помилка користувача
Чим більше зразків обробляється, тим вищий ризик помилки.Може легко статися, що зразок піпеткою потрапить не в ту посудину або не в ту лунку.Цей ризик можна значно зменшити за допомогою легко помітного маркування свердловин.Завдяки автоматизації етапів дозування «людський фактор», тобто помилки та варіації, пов’язані з користувачем, мінімізуються, таким чином підвищуючи відтворюваність, особливо у випадку малих об’ємів реакції.Це вимагає пластин з достатньою стабільністю розмірів для використання на робочій станції.Прикріплені штрих-коди забезпечують додаткову машиночитаність, що спрощує відстеження зразків протягом усього процесу.
Програмування термоциклера
Програмування приладу може зайняти багато часу та бути схильним до помилок.Різні функції термоциклера ПЛР працюють разом, щоб спростити цей етап процесу і, що найважливіше, зробити його безпечним:
Просте керування та якісне керівництво користувачем є основою ефективного програмування.Спираючись на цю основу, захищене паролем адміністрування користувачів запобігатиме зміні власних програм іншими користувачами.Якщо використовується кілька циклерів (одного типу), корисно, якщо програму можна перенести безпосередньо з одного приладу на інший через USB або підключення.Комп’ютерне програмне забезпечення забезпечує централізоване та безпечне адміністрування програм, прав користувача та документів на комп’ютері.
Прогон ПЛР
Під час циклу ДНК ампліфікується в реакційному посудині, де кожен зразок має бути підданий ідентичним, послідовним умовам реакції.Для процесу актуальні такі аспекти:
Контроль температури
Чудова точність контролю температури та однорідність блоку циклера є основою для рівномірного температурного кондиціонування всіх зразків.Висока якість нагрівальних і охолоджуючих елементів (елементів Пельтьє), а також спосіб їх підключення до блоку є вирішальними факторами, які визначатимуть ризик розбіжностей температури, відомих як «ефект краю»
Випаровування
Концентрації окремих компонентів реакції не повинні змінюватися протягом реакції через випаровування.В іншому випадку, можливо, що дуже малоПродукт ПЛРможе бути згенерований або не створюватися взагалі.Тому надзвичайно важливо звести до мінімуму випаровування, забезпечивши надійне ущільнення.У цьому випадку нагріта кришка термоциклера і ущільнювач посудини працюють рука об руку.Доступні різні варіанти ущільненняПланшети для ПЛР (посилання: Стаття про запечатування), завдяки чому найкраще ущільнення досягається завдяки термозварюванню.Інші запірні пристрої також можуть підійти, якщо контактний тиск кришки циклера можна відрегулювати відповідно до вибраного ущільнення.
Для забезпечення точних і відтворюваних результатів у довгостроковій перспективі існує стандартизація процесу.Сюди входить регулярне технічне обслуговування обладнання, щоб воно завжди було в хорошому робочому стані.Усі витратні матеріали мають бути незмінно високої якості для всіх вироблених партій, і їх надійна доступність має бути гарантована.
Час публікації: 29 листопада 2022 р