De standaardisatie van processen omvat de optimalisatie ervan en de daaropvolgende inrichting en harmonisatie, waardoor optimale prestaties op de lange termijn mogelijk zijn – onafhankelijk van de gebruiker.Standaardisatie zorgt voor resultaten van hoge kwaliteit, evenals de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid ervan.
Het doel van (klassieke) PCR is het genereren van een betrouwbaar en reproduceerbaar resultaat.Voor bepaalde toepassingen kan de opbrengst van dePCR-productis ook relevant.Bij deze reacties moet ervoor worden gezorgd dat de monsters niet worden aangetast en dat de PCR-workflow stabiel blijft.Concreet vertaalt dit zich in het minimaliseren van de introductie van besmettingen die zouden kunnen leiden tot vals-positieve of vals-negatieve resultaten of zelfs de PCR-reactie zouden kunnen remmen.Bovendien moeten de reactieomstandigheden voor elk afzonderlijk monster binnen een run zo identiek mogelijk zijn en ook overdraagbaar zijn naar volgende reacties (van dezelfde methode).Dit heeft zowel betrekking op de samenstelling van de reacties als op het type temperatuurregeling in de cycler.Gebruikersfouten moeten uiteraard zoveel mogelijk worden vermeden.
Hieronder zullen we de uitdagingen demonstreren die u tegenkomt tijdens de voorbereiding en tijdens de uitvoering van een PCR – en de benaderingen van oplossingen die bestaan met betrekking tot instrumenten en verbruiksartikelen die worden gebruikt voor de standaardisatie van de PCR-workflows.
Voorbereiding van de reactie
Het distribueren van reactiecomponenten in respectievelijk PCR-vaten of platen omvat meerdere uitdagingen die moeten worden overwonnen:
Reactieomstandigheden
De exacte en nauwkeurige dosering van de afzonderlijke componenten is onmisbaar bij het streven naar zo identiek mogelijke reactieomstandigheden.Naast een goede pipetteertechniek is het selecteren van het juiste gereedschap van cruciaal belang.PCR-mastermixen bevatten vaak stoffen die de viscositeit verhogen of schuim genereren.Tijdens het pipetteerproces leiden deze tot aanzienlijke bevochtiging van de vloeistofpipetpunten, waardoor de pipetteernauwkeurigheid wordt verminderd.Het gebruik van directe doseersystemen of alternatieve pipetpunten die minder gevoelig zijn voor bevochtiging, kan de nauwkeurigheid en precisie van het pipetteerproces verbeteren.
Verontreinigingen
Tijdens het doseerproces worden aerosolen gegenereerd die, als ze de binnenkant van de pipet bereiken, mogelijk een ander monster kunnen besmetten tijdens de volgende pipetteerstap.Dit kan worden voorkomen door gebruik te maken van filtertips of directe verplaatsingssystemen.
Verbruiksartikelen zoalstipsmogen vaten en platen die worden gebruikt in de PCR-workflow geen stoffen bevatten die het monster in gevaar brengen of het resultaat vervalsen.Deze omvatten DNA, DNases, RNases en PCR-remmers, evenals componenten die tijdens de reactie mogelijk uit het materiaal kunnen lekken – stoffen die bekend staan als uitloogbare stoffen.
Gebruikersfout
Hoe meer monsters er worden verwerkt, hoe groter het foutenrisico.Het kan gemakkelijk gebeuren dat een monster in het verkeerde vat of de verkeerde put wordt gepipetteerd.Dit risico kan aanzienlijk worden verminderd door een gemakkelijk waarneembare markering van de putjes.Door de automatisering van de doseerstappen wordt de “menselijke factor”, dat wil zeggen fouten en gebruikersgerelateerde variaties, geminimaliseerd, waardoor de reproduceerbaarheid toeneemt, vooral in het geval van kleine reactievolumes.Dit vereist dat platen met voldoende maatvastheid in een werkstation worden gebruikt.Bijgevoegde streepjescodes zorgen voor extra machineleesbaarheid, wat het volgen van monsters gedurende het hele proces vereenvoudigt.
Programmering van de thermocycler
Het programmeren van een instrument kan tijdrovend en foutgevoelig blijken te zijn.Verschillende functies van de PCR-thermocycler werken samen om deze processtap te vereenvoudigen en, belangrijker nog, om deze veilig te maken:
Eenvoudige bediening en goede gebruikersbegeleiding vormen de basis voor efficiënt programmeren.Op basis van deze basis zal een met een wachtwoord beveiligd gebruikersbeheer voorkomen dat de eigen programma's door andere gebruikers worden gewijzigd.Als er meerdere cyclers (van hetzelfde type) in gebruik zijn, is het voordelig als een programma via USB of connectiviteit rechtstreeks van het ene instrument naar het andere kan worden overgedragen.Computersoftware maakt centraal en veilig beheer van programma's, gebruikersrechten en documenten op een computer mogelijk.
PCR-run
Tijdens de run wordt DNA geamplificeerd in het reactievat, waar elk monster aan identieke, consistente reactieomstandigheden moet worden onderworpen.Voor het proces zijn de volgende aspecten relevant:
Temperatuurregeling
Uitstekende nauwkeurigheid bij temperatuurregeling en homogeniteit van het cyclerblok vormen de basis voor een gelijkmatige temperatuurconditionering van alle monsters.De hoge kwaliteit van de verwarmings- en koelelementen (peltier-elementen), evenals de manier waarop deze met het blok zijn verbonden, zijn de doorslaggevende factoren die het risico op temperatuurverschillen, ook wel het “randeffect” genoemd, zullen bepalen.
Verdamping
De concentraties van de afzonderlijke reactiecomponenten mogen in de loop van de reactie niet veranderen als gevolg van verdamping.Anders is het mogelijk dat heel weinigPCR-productkan worden gegenereerd, of helemaal niet.Het is daarom van cruciaal belang om verdamping tot een minimum te beperken door voor een veilige afdichting te zorgen.In dit geval werken het verwarmde deksel van de thermocycler en de afdichting van het vat hand in hand.Er zijn verschillende afdichtingsopties beschikbaarPCR-platen (link: Afdichtingsartikel), waarbij de beste afdichting wordt bereikt door middel van heatseal.Andere sluitingen kunnen ook geschikt zijn, zolang de contactdruk van het fietsdeksel maar aan de gekozen afdichting kan worden aangepast.
Er vindt processtandaardisatie plaats om op de lange termijn nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te garanderen.Dit omvat regelmatig onderhoud van de apparatuur om ervoor te zorgen dat deze altijd in goede staat verkeert.Alle verbruiksartikelen moeten van een consistent hoge kwaliteit zijn in alle geproduceerde partijen, en hun betrouwbare beschikbaarheid moet worden gegarandeerd.
Posttijd: 29 november 2022