Η τυποποίηση των διαδικασιών περιλαμβάνει τη βελτιστοποίηση και την επακόλουθη καθιέρωση και εναρμόνισή τους, επιτρέποντας τη μακροπρόθεσμη βέλτιστη απόδοση – ανεξάρτητα από τον χρήστη.Η τυποποίηση εξασφαλίζει αποτελέσματα υψηλής ποιότητας, καθώς και την αναπαραγωγιμότητα και τη συγκρισιμότητα τους.
Στόχος της (κλασικής) PCR είναι η παραγωγή ενός αξιόπιστου και αναπαραγώγιμου αποτελέσματος.Για ορισμένες εφαρμογές, η απόδοση τουΠροϊόν PCRείναι επίσης σχετικό.Για αυτές τις αντιδράσεις, πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να διασφαλιστεί ότι τα δείγματα δεν διακυβεύονται και ότι η ροή εργασίας PCR παραμένει σταθερή.Συγκεκριμένα, αυτό μεταφράζεται στην ελαχιστοποίηση της εισαγωγής μολύνσεων που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα ή ακόμη και να αναστείλουν την αντίδραση PCR.Επιπλέον, οι συνθήκες αντίδρασης θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν ταυτόσημες για κάθε μεμονωμένο δείγμα σε μια σειρά και επίσης να μπορούν να μεταφερθούν σε επόμενες αντιδράσεις (της ίδιας μεθόδου).Αυτό αναφέρεται στη σύνθεση των αντιδράσεων καθώς και στον τύπο ελέγχου θερμοκρασίας στον κυκλοποιητή.Τα σφάλματα χρήστη, φυσικά, πρέπει να αποφεύγονται όσο το δυνατόν περισσότερο.
Παρακάτω, θα δείξουμε τις προκλήσεις που αντιμετωπίζονται κατά την προετοιμασία και καθ' όλη τη διάρκεια μιας PCR - και τις προσεγγίσεις λύσεων που υπάρχουν σε σχέση με όργανα και αναλώσιμα που χρησιμοποιούνται για την τυποποίηση των ροών εργασίας PCR.
Προετοιμασία αντίδρασης
Η διανομή των συστατικών της αντίδρασης σε δοχεία PCR, ή πλάκες, αντίστοιχα, περιλαμβάνει πολλαπλές προκλήσεις που πρέπει να ξεπεραστούν:
Συνθήκες αντίδρασης
Η ακριβής και ακριβής δοσολογία των μεμονωμένων συστατικών είναι απαραίτητη όταν επιδιώκουμε τις πιο ίδιες συνθήκες αντίδρασης.Εκτός από μια καλή τεχνική πιπέτας, η επιλογή του σωστού εργαλείου είναι κρίσιμη.Τα κύρια μείγματα PCR περιέχουν συχνά ουσίες που αυξάνουν το ιξώδες ή δημιουργούν αφρό.Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας εισαγωγής με πιπέτα, αυτά οδηγούν σε ουσιαστική διαβροχή τουάκρες πιπέτας, μειώνοντας έτσι την ακρίβεια της πιπέτας.Η χρήση συστημάτων άμεσης διανομής ή εναλλακτικών άκρων πιπέτας που είναι λιγότερο επιρρεπείς σε διαβροχή μπορεί να βελτιώσει την ακρίβεια και την ακρίβεια της διαδικασίας εκτόξευσης πιπέτας.
Μολύνσεις
Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διανομής, παράγονται αερολύματα τα οποία, εάν αφεθούν να φτάσουν στο εσωτερικό της πιπέτας, μπορούν ενδεχομένως να μολύνουν ένα άλλο δείγμα κατά το επόμενο βήμα της πιπέτας.Αυτό μπορεί να αποφευχθεί χρησιμοποιώντας άκρες φίλτρων ή συστήματα άμεσης μετατόπισης.
Αναλώσιμα όπως π.χσυμβουλές, τα δοχεία και οι πλάκες που χρησιμοποιούνται στη ροή εργασιών PCR δεν πρέπει να περιέχουν ουσίες που διακυβεύουν το δείγμα ή παραποιούν το αποτέλεσμα.Αυτά περιλαμβάνουν DNA, DNases, RNases και αναστολείς PCR, καθώς και συστατικά που ενδέχεται να εκπλυθούν από το υλικό κατά τη διάρκεια της αντίδρασης – ουσίες γνωστές ως εκπλυσίμες.
Σφάλμα χρήστη
Όσο περισσότερα δείγματα υποβάλλονται σε επεξεργασία, τόσο μεγαλύτερος είναι ο κίνδυνος σφάλματος.Μπορεί εύκολα να συμβεί ένα δείγμα να μπει με πιπέτα σε λάθος δοχείο ή σε λάθος φρεάτιο.Αυτός ο κίνδυνος μπορεί να μειωθεί σημαντικά με την ευδιάκριτη σήμανση των φρεατίων.Μέσω της αυτοματοποίησης των βημάτων διανομής, ο «ανθρώπινος παράγοντας», δηλαδή τα σφάλματα και οι παραλλαγές που σχετίζονται με τον χρήστη, ελαχιστοποιούνται, αυξάνοντας έτσι την αναπαραγωγιμότητα, ειδικά στην περίπτωση μικρών όγκων αντίδρασης.Αυτό απαιτεί πλάκες με επαρκή σταθερότητα διαστάσεων για να χρησιμοποιηθούν σε ένα σταθμό εργασίας.Οι προσαρτημένοι γραμμικοί κώδικες παρέχουν πρόσθετη αναγνωσιμότητα από μηχανή, η οποία απλοποιεί την παρακολούθηση δειγμάτων σε όλη τη διαδικασία.
Προγραμματισμός του θερμοκυκλωτή
Ο προγραμματισμός ενός οργάνου μπορεί να αποδειχθεί χρονοβόρος καθώς και επιρρεπής σε σφάλματα.Τα διαφορετικά χαρακτηριστικά του θερμικού κυκλοποιητή PCR συνεργάζονται για να απλοποιήσουν αυτό το βήμα της διαδικασίας και, το πιο σημαντικό, να το καταστήσουν ασφαλές:
Η εύκολη λειτουργία και η καλή καθοδήγηση του χρήστη αποτελούν τη βάση του αποτελεσματικού προγραμματισμού.Χτίζοντας σε αυτό το θεμέλιο, η διαχείριση χρηστών που προστατεύεται με κωδικό πρόσβασης θα αποτρέψει την αλλαγή των προγραμμάτων κάποιου από άλλους χρήστες.Εάν χρησιμοποιούνται πολλαπλοί κυκλοποιητές (του ίδιου τύπου), είναι ωφέλιμο εάν ένα πρόγραμμα μπορεί να μεταφερθεί απευθείας από το ένα όργανο στο άλλο μέσω USB ή συνδεσιμότητας.Το λογισμικό υπολογιστή επιτρέπει την κεντρική και ασφαλή διαχείριση προγραμμάτων, δικαιωμάτων χρήστη και εγγράφων σε έναν υπολογιστή.
Εκτέλεση PCR
Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, το DNA ενισχύεται στο δοχείο αντίδρασης, όπου κάθε δείγμα πρέπει να υποβληθεί σε ίδιες, συνεπείς συνθήκες αντίδρασης.Οι ακόλουθες πτυχές είναι σχετικές με τη διαδικασία:
Ελεγχος θερμοκρασίας
Η εξαιρετική ακρίβεια στον έλεγχο θερμοκρασίας και η ομοιογένεια του μπλοκ κυκλοποιητή αποτελούν τη βάση για ομοιόμορφη ρύθμιση θερμοκρασίας όλων των δειγμάτων.Η υψηλή ποιότητα των στοιχείων θέρμανσης και ψύξης (στοιχεία peltier), καθώς και ο τρόπος με τον οποίο αυτά συνδέονται με το μπλοκ, είναι οι αποφασιστικοί παράγοντες που θα καθορίσουν τον κίνδυνο διαφορών θερμοκρασίας γνωστού ως «φαινόμενο άκρου».
Εξάτμιση
Οι συγκεντρώσεις των επιμέρους συστατικών της αντίδρασης δεν πρέπει να αλλάζουν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης λόγω εξάτμισης.Διαφορετικά, είναι πιθανό ότι πολύ λίγοΠροϊόν PCRμπορεί να δημιουργηθεί ή καθόλου.Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να ελαχιστοποιηθεί η εξάτμιση διασφαλίζοντας μια ασφαλή σφράγιση.Σε αυτή την περίπτωση, το θερμαινόμενο καπάκι του θερμοκυκλωτή και η σφράγιση του δοχείου λειτουργούν χέρι-χέρι.Διατίθενται διαφορετικές επιλογές σφράγισης γιαΠλάκες PCR (σύνδεσμος: Σφραγιστικό αντικείμενο), όπου η καλύτερη σφράγιση επιτυγχάνεται μέσω θερμοσφράγισης.Άλλα πώματα μπορεί επίσης να είναι κατάλληλα, εφόσον η πίεση επαφής του καπακιού του κυκλοποιητή μπορεί να ρυθμιστεί στην επιλεγμένη σφράγιση.
Υπάρχει τυποποίηση των διαδικασιών προκειμένου να διασφαλιστούν ακριβή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα μακροπρόθεσμα.Αυτό περιλαμβάνει την τακτική συντήρηση του εξοπλισμού για να διασφαλιστεί ότι είναι πάντα σε καλή κατάσταση λειτουργίας.Όλα τα αναλώσιμα θα πρέπει να είναι σταθερά υψηλής ποιότητας σε όλες τις παρτίδες που παράγονται και η αξιόπιστη διαθεσιμότητά τους πρέπει να είναι εγγυημένη.
Ώρα δημοσίευσης: Νοε-29-2022