Standardizacija procesov vključuje njihovo optimizacijo in posledično vzpostavitev ter harmonizacijo, kar omogoča dolgoročno optimalno delovanje – neodvisno od uporabnika. Standardizacija zagotavlja visokokakovostne rezultate ter njihovo ponovljivost in primerljivost.
Cilj (klasične) PCR je pridobitev zanesljivega in ponovljivega rezultata. Za nekatere aplikacije je izkoristekPCR produktje prav tako pomembno. Pri teh reakcijah je treba paziti, da vzorci niso ogroženi in da potek dela PCR ostane stabilen. To se nanaša predvsem na zmanjšanje vnosa kontaminacij, ki bi lahko povzročile lažno pozitivne ali lažno negativne rezultate ali celo zavrle reakcijo PCR. Poleg tega morajo biti reakcijski pogoji čim bolj enaki za vsak posamezen vzorec znotraj enega niza in prenosljivi na nadaljnje reakcije (iste metode). To se nanaša tako na sestavo reakcij kot na vrsto nadzora temperature v ciklerju. Seveda se je treba čim bolj izogniti uporabniškim napakam.
Spodaj bomo prikazali izzive, s katerimi se srečujemo med pripravo in potekom PCR – in pristope k rešitvam, ki obstajajo v zvezi z instrumenti in potrošnim materialom, ki se uporabljajo za standardizacijo delovnih procesov PCR.
Priprava reakcije
Doziranje reakcijskih komponent v PCR-posode oziroma plošče vključuje več izzivov, ki jih je treba premagati:
Reakcijski pogoji
Natančno in precizno odmerjanje posameznih komponent je nepogrešljivo pri doseganju čim bolj enakih reakcijskih pogojev. Poleg dobre tehnike pipetiranja je ključnega pomena tudi izbira pravega orodja. PCR master mešanice pogosto vsebujejo snovi, ki povečajo viskoznost ali tvorijo peno. Med postopkom pipetiranja to povzroči znatno omočenje mešanice.konice pipet, s čimer se zmanjša natančnost pipetiranja. Uporaba sistemov za neposredno doziranje ali alternativnih konic pipet, ki so manj nagnjene k omočenju, lahko izboljša natančnost in preciznost postopka pipetiranja.
Kontaminacije
Med postopkom doziranja nastajajo aerosoli, ki lahko, če dosežejo notranjost pipete, kontaminirajo drug vzorec med naslednjim korakom pipetiranja. To je mogoče preprečiti z uporabo filtrirnih konic ali sistemov za neposredno izpodrivanje.
Potrošni material, kot sonasvetiPosode in plošče, ki se uporabljajo v postopku PCR, ne smejo vsebovati snovi, ki bi lahko ogrozile vzorec ali ponaredile rezultat. Sem spadajo DNK, DNaze, RNaze in zaviralci PCR, pa tudi komponente, ki se lahko med reakcijo izlužijo iz materiala – snovi, znane kot izlužljive snovi.
Napaka uporabnika
Več vzorcev kot je obdelanih, večje je tveganje napak. Zlahka se zgodi, da se vzorec pipetira v napačno posodo ali napačno vdolbinico. To tveganje je mogoče znatno zmanjšati z enostavno prepoznavnim označevanjem vdolbinic. Z avtomatizacijo korakov doziranja se "človeški dejavnik", tj. napake in odstopanja, povezana z uporabnikom, zmanjšajo na minimum, s čimer se poveča ponovljivost, zlasti pri majhnih reakcijskih volumnih. To zahteva uporabo plošč z zadostno dimenzijsko stabilnostjo v delovni postaji. Priložene črtne kode zagotavljajo dodatno strojno berljivost, kar poenostavlja sledenje vzorcem skozi celoten postopek.
Programiranje termociklerja
Programiranje instrumenta je lahko zamudno in nagnjeno k napakam. Različne funkcije termociklerja PCR skupaj poenostavljajo ta korak postopka in, kar je najpomembneje, zagotavljajo njegovo varnost:
Enostavno upravljanje in dobro vodenje uporabnika sta osnova učinkovitega programiranja. Na tej podlagi bo z geslom zaščiteno upravljanje uporabnikov preprečilo, da bi drugi uporabniki spreminjali lastne programe. Če se uporablja več ciklerjev (iste vrste), je koristno, če je program mogoče prenesti neposredno iz enega instrumenta v drugega prek USB-ja ali povezljivosti. Računalniška programska oprema omogoča centralno in varno upravljanje programov, uporabniških pravic in dokumentov v računalniku.
PCR test
Med postopkom se DNK amplificira v reakcijski posodi, kjer mora biti vsak vzorec podvržen enakim, doslednim reakcijskim pogojem. Za postopek so pomembni naslednji vidiki:
Nadzor temperature
Odlična natančnost pri nadzoru temperature in homogenost cikličnega bloka sta osnova za enakomerno temperaturno kondicioniranje vseh vzorcev. Visoka kakovost grelnih in hladilnih elementov (Peltierjevih elementov) ter način njihove povezave z blokom sta odločilna dejavnika, ki določata tveganje za temperaturna odstopanja, znana kot "robni učinek".
Izhlapevanje
Koncentracije posameznih reakcijskih komponent se med reakcijo ne smejo spreminjati zaradi izhlapevanja. V nasprotnem primeru je možno, da se zelo maloPCR produktlahko nastane ali pa sploh ne. Zato je ključnega pomena, da se izhlapevanje čim bolj zmanjša z zagotavljanjem varnega tesnjenja. V tem primeru ogrevan pokrov termociklerja in tesnilo posode delujeta z roko v roki. Na voljo so različne možnosti tesnjenja zaPCR plošče (povezava: Članek o tesnjenju), pri čemer se najboljše tesnjenje doseže s toplotnim varjenjem. Primerna so lahko tudi druga zapirala, če je mogoče kontaktni tlak pokrova ciklerja prilagoditi izbranemu tesnilu.
Za dolgoročno zagotavljanje natančnih in ponovljivih rezultatov je vzpostavljena standardizacija procesov. To vključuje redno vzdrževanje opreme, da se zagotovi njeno stalno delovanje v dobrem stanju. Vsi potrošni materiali morajo biti dosledno visoke kakovosti v vseh proizvedenih serijah, zagotovljena pa mora biti tudi njihova zanesljiva razpoložljivost.
Čas objave: 29. november 2022