Štandardizácia procesov zahŕňa ich optimalizáciu a následné stanovenie a harmonizáciu, čo umožňuje dlhodobý optimálny výkon – nezávisle od používateľa. Štandardizácia zabezpečuje vysokokvalitné výsledky, ako aj ich reprodukovateľnosť a porovnateľnosť.
Cieľom (klasickej) PCR je dosiahnutie spoľahlivého a reprodukovateľného výsledku. Pre určité aplikácie je výťažokPCR produktje tiež relevantné. Pri týchto reakciách je potrebné dbať na to, aby vzorky neboli ohrozené a aby pracovný postup PCR zostal stabilný. Konkrétne sa to prejavuje v minimalizácii zavádzania kontaminácií, ktoré by mohli viesť k falošne pozitívnym alebo falošne negatívnym výsledkom alebo dokonca inhibovať reakciu PCR. Okrem toho by reakčné podmienky mali byť čo najviac identické pre každú jednotlivú vzorku v rámci jedného cyklu a mali by byť prenosné aj na následné reakcie (rovnakou metódou). To sa týka zloženia reakcií, ako aj typu regulácie teploty v cykléri. Samozrejme, je potrebné čo najviac sa vyhnúť chybám používateľa.
Nižšie uvedieme výzvy, s ktorými sa stretávame počas prípravy a počas celého priebehu PCR – a prístupy k riešeniam, ktoré existujú v súvislosti s prístrojmi a spotrebným materiálom používaným na štandardizáciu pracovných postupov PCR.
Príprava reakcie
Dávkovanie reakčných zložiek do PCR nádob alebo platní zahŕňa viacero výziev, ktoré je potrebné prekonať:
Reakčné podmienky
Presné a precízne dávkovanie jednotlivých zložiek je nevyhnutné pri snahe o dosiahnutie čo najzhodnejších reakčných podmienok. Okrem dobrej pipetovacej techniky je kľúčový aj výber správneho nástroja. PCR mastermixy často obsahujú látky, ktoré zvyšujú viskozitu alebo vytvárajú penu. Počas pipetovacieho procesu to vedie k výraznému zmáčaniu zmesi.hroty pipety, čím sa znižuje presnosť pipetovania. Použitie systémov priameho dávkovania alebo alternatívnych pipetovacích špičiek, ktoré sú menej náchylné na zmáčanie, môže zlepšiť presnosť a precíznosť procesu pipetovania.
Kontaminácie
Počas procesu dávkovania sa vytvárajú aerosóly, ktoré, ak sa dostanú do vnútra pipety, môžu potenciálne kontaminovať ďalšiu vzorku počas nasledujúceho kroku pipetovania. Tomu sa dá zabrániť použitím filtračných špičiek alebo systémov priameho vytlačovania.
Spotrebný materiál, ako napr.tipyNádoby a platne používané v PCR procese nesmú obsahovať látky, ktoré by mohli ohroziť vzorku alebo sfalšovať výsledok. Patria sem DNA, DNázy, RNázy a inhibítory PCR, ako aj zložky, ktoré sa môžu počas reakcie potenciálne vylúhovať z materiálu – látky známe ako vylúhovateľné látky.
Chyba používateľa
Čím viac vzoriek sa spracuje, tým vyššie je riziko chyby. Ľahko sa môže stať, že vzorka sa napipetuje do nesprávnej nádoby alebo nesprávnej jamky. Toto riziko sa dá výrazne znížiť ľahko rozpoznateľným označením jamiek. Automatizáciou krokov dávkovania sa minimalizuje „ľudský faktor“, teda chyby a odchýlky súvisiace s používateľom, čím sa zvyšuje reprodukovateľnosť, najmä v prípade malých reakčných objemov. To si vyžaduje použitie platní s dostatočnou rozmerovou stabilitou v pracovnej stanici. Pripojené čiarové kódy poskytujú dodatočnú strojovú čitateľnosť, čo zjednodušuje sledovanie vzorky počas celého procesu.
Programovanie termocykléra
Programovanie prístroja môže byť časovo náročné a náchylné na chyby. Rôzne funkcie PCR termocykléra spolupracujú na zjednodušení tohto procesného kroku a predovšetkým na jeho bezpečnosti:
Jednoduchá obsluha a dobré pokyny pre používateľa sú základom efektívneho programovania. Na tomto základe zabráni správa používateľov chránená heslom zmene vlastných programov inými používateľmi. Ak sa používa viacero cyklérov (rovnakého typu), je výhodné, ak je možné program preniesť priamo z jedného prístroja do druhého cez USB alebo pripojenie. Počítačový softvér umožňuje centrálnu a bezpečnú správu programov, používateľských práv a dokumentov v počítači.
PCR priebeh
Počas analýzy sa DNA amplifikuje v reakčnej nádobe, kde by každá vzorka mala byť vystavená identickým, konzistentným reakčným podmienkam. Pre tento proces sú relevantné nasledujúce aspekty:
Regulácia teploty
Vynikajúca presnosť regulácie teploty a homogenita bloku cykléra sú základom pre rovnomerné temperovanie všetkých vzoriek. Vysoká kvalita vykurovacích a chladiacich prvkov (Peltierove články), ako aj spôsob ich pripojenia k bloku, sú rozhodujúcimi faktormi, ktoré určia riziko teplotných odchýlok známych ako „okrajový efekt“.
Odparovanie
Koncentrácie jednotlivých reakčných zložiek by sa nemali v priebehu reakcie meniť v dôsledku odparovania. V opačnom prípade je možné, že sa vylúči len veľmi máloPCR produktmôže sa generovať alebo sa vôbec nevyparuje. Preto je nevyhnutné minimalizovať odparovanie zabezpečením bezpečného utesnenia. V tomto prípade vyhrievané veko termocykléra a utesnenie nádoby spolupracujú ruka v ruke. K dispozícii sú rôzne možnosti utesnenia prePCR platne (odkaz: Článok o uzatváraní), pričom najlepšie utesnenie sa dosiahne tepelným zvarením. Vhodné môžu byť aj iné uzávery, pokiaľ je možné prispôsobiť kontaktný tlak viečka cykléra zvolenému tesneniu.
Na zabezpečenie presných a reprodukovateľných výsledkov v dlhodobom horizonte je zavedená štandardizácia procesov. Zahŕňa to pravidelnú údržbu zariadení, aby sa zabezpečilo, že sú vždy v dobrom prevádzkovom stave. Všetok spotrebný materiál by mal mať konzistentne vysokú kvalitu vo všetkých vyrobených šaržiach a musí byť zaručená jeho spoľahlivá dostupnosť.
Čas uverejnenia: 29. novembra 2022