Standardisering av prosesser omfatter optimalisering og påfølgende etablering og harmonisering, noe som muliggjør langsiktig optimal ytelse – uavhengig av brukeren. Standardisering sikrer resultater av høy kvalitet, samt reproduserbarhet og sammenlignbarhet.
Målet med (klassisk) PCR er å generere et pålitelig og reproduserbart resultat. For visse bruksområder er utbyttet avPCR-produkter også relevant. For disse reaksjonene må man sørge for at prøvene ikke kompromitteres og at PCR-arbeidsflyten forblir stabil. Spesielt betyr dette å minimere introduksjonen av kontaminering som kan føre til falske positive eller falske negative resultater eller til og med hemme PCR-reaksjonen. Videre bør reaksjonsbetingelsene være så identiske som mulig for hver enkelt prøve i en kjøring og også kunne overføres til påfølgende reaksjoner (med samme metode). Dette refererer til reaksjonenes sammensetning samt typen temperaturkontroll i sykleren. Brukerfeil skal selvfølgelig unngås så mye som mulig.
Nedenfor vil vi demonstrere utfordringene som oppstår under forberedelsene og gjennom hele PCR-prosessen – og løsningene som finnes med hensyn til instrumenter og forbruksvarer som brukes til standardisering av PCR-arbeidsflytene.
Reaksjonsforberedelse
Dispensering av reaksjonskomponenter i henholdsvis PCR-beholdere eller -plater innebærer flere utfordringer som må overvinnes:
Reaksjonsbetingelser
Nøyaktig og presis dosering av de enkelte komponentene er uunnværlig når man sikter mot mest mulig identiske reaksjonsbetingelser. I tillegg til en god pipetteringsteknikk er det avgjørende å velge riktig verktøy. PCR-mastermikser inneholder ofte stoffer som øker viskositeten eller genererer skum. Under pipetteringsprosessen fører disse til betydelig fukting avpipettespisser, noe som reduserer pipetteringsnøyaktigheten. Bruk av direkte dispenseringssystemer eller alternative pipettespisser som er mindre utsatt for fukting, kan forbedre nøyaktigheten og presisjonen i pipetteringsprosessen.
Forurensninger
Under dispenseringsprosessen genereres aerosoler som, hvis de kommer inn i pipetten, potensielt kan forurense en annen prøve under neste pipetteringstrinn. Dette kan forhindres ved å bruke filterspisser eller direkte fortrengningssystemer.
Forbruksvarer som f.eks.tipsBeholdere og plater som brukes i PCR-arbeidsflyten må ikke inneholde stoffer som kompromitterer prøven eller forfalsker resultatet. Disse inkluderer DNA, DNaser, RNaser og PCR-hemmere, samt komponenter som potensielt kan lekke ut fra materialet under reaksjonen – stoffer kjent som utlekkelige stoffer.
Brukerfeil
Jo flere prøver som behandles, desto høyere er feilrisikoen. Det kan lett skje at en prøve pipetteres over i feil beholder eller feil brønn. Denne risikoen kan reduseres betraktelig ved lett synlig merking av brønnene. Gjennom automatisering av dispenseringstrinnene minimeres den "menneskelige faktoren", dvs. feil og brukerrelaterte variasjoner, noe som øker reproduserbarheten, spesielt ved små reaksjonsvolumer. Dette krever plater med tilstrekkelig dimensjonsstabilitet som kan brukes i en arbeidsstasjon. Vedlagte strekkoder gir ekstra maskinlesbarhet, noe som forenkler prøvesporing gjennom hele prosessen.
Programmering av termosykleren
Programmering av et instrument kan vise seg å være tidkrevende og utsatt for feil. Ulike PCR-termosyklerfunksjoner samarbeider for å forenkle dette prosesstrinnet og, viktigst av alt, for å gjøre det trygt:
Enkel betjening og god brukerveiledning er grunnlaget for effektiv programmering. Byggende på dette fundamentet vil passordbeskyttet brukeradministrasjon forhindre at egne programmer endres av andre brukere. Hvis flere syklere (av samme type) er i bruk, er det fordelaktig om et program kan overføres direkte fra ett instrument til et annet via USB eller tilkobling. Dataprogramvare muliggjør sentral og sikker administrasjon av programmer, brukerrettigheter og dokumenter på en datamaskin.
PCR-kjøring
Under kjøringen amplifiseres DNA i reaksjonsbeholderen, hvor hver prøve skal utsettes for identiske, konsistente reaksjonsbetingelser. Følgende aspekter er relevante for prosessen:
Temperaturkontroll
Utmerket nøyaktighet i temperaturkontroll og homogenitet i syklerblokken er grunnlaget for jevn temperaturbehandling av alle prøver. Den høye kvaliteten på varme- og kjøleelementene (peltier-elementer), samt måten disse er koblet til blokken på, er de avgjørende faktorene som vil bestemme risikoen for temperaturavvik kjent som «kanteffekten».
Fordampning
Konsentrasjonene av de enkelte reaksjonskomponentene skal ikke endres i løpet av reaksjonen på grunn av fordampning. Ellers er det mulig at svært litePCR-produktkan genereres, eller ingen i det hele tatt. Det er derfor avgjørende å minimere fordampning ved å sikre en sikker forsegling. I dette tilfellet fungerer det oppvarmede lokket på termosykleren og forseglingen på beholderen hånd i hånd. Ulike forseglingsalternativer er tilgjengelige forPCR-plater (lenke: Artikkel om forsegling), hvorved den beste forseglingen oppnås gjennom varmeforsegling. Andre lukninger kan også være passende, så lenge kontakttrykket på syklerlokket kan justeres til den valgte forseglingen.
Prosessstandardisering er på plass for å sikre nøyaktige og reproduserbare resultater på lang sikt. Dette inkluderer regelmessig vedlikehold av utstyret for å sikre at det alltid er i god stand. Alle forbruksvarer skal være av gjennomgående høy kvalitet på tvers av alle produserte partier, og pålitelig tilgjengelighet må garanteres.
Publisert: 29. november 2022