Η τυποποίηση των διαδικασιών περιλαμβάνει τη βελτιστοποίησή τους και την επακόλουθη καθιέρωση και εναρμόνιση, επιτρέποντας τη μακροπρόθεσμη βέλτιστη απόδοση – ανεξάρτητα από τον χρήστη. Η τυποποίηση διασφαλίζει αποτελέσματα υψηλής ποιότητας, καθώς και την αναπαραγωγιμότητα και συγκρισιμότητά τους.
Ο στόχος της (κλασικής) PCR είναι η παραγωγή ενός αξιόπιστου και αναπαραγώγιμου αποτελέσματος. Για ορισμένες εφαρμογές, η απόδοση τουΠροϊόν PCRείναι επίσης σχετικό. Για αυτές τις αντιδράσεις, πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να διασφαλίζεται ότι τα δείγματα δεν θα επηρεάζονται και ότι η ροή εργασίας της PCR παραμένει σταθερή. Συγκεκριμένα, αυτό μεταφράζεται στην ελαχιστοποίηση της εισαγωγής μολύνσεων που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα ή ακόμη και να αναστείλουν την αντίδραση PCR. Επιπλέον, οι συνθήκες αντίδρασης θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο πανομοιότυπες για κάθε μεμονωμένο δείγμα σε μια εκτέλεση και επίσης να μπορούν να μεταφερθούν σε επόμενες αντιδράσεις (της ίδιας μεθόδου). Αυτό αναφέρεται στη σύνθεση των αντιδράσεων καθώς και στον τύπο ελέγχου θερμοκρασίας στον κυκλοποιητή. Τα σφάλματα χρήστη, φυσικά, πρέπει να αποφεύγονται όσο το δυνατόν περισσότερο.
Παρακάτω, θα παρουσιάσουμε τις προκλήσεις που αντιμετωπίζονται κατά την προετοιμασία και καθ' όλη τη διάρκεια μιας PCR – και τις προσεγγίσεις στις λύσεις που υπάρχουν σε σχέση με τα όργανα και τα αναλώσιμα που χρησιμοποιούνται για την τυποποίηση των ροών εργασίας της PCR.
Προετοιμασία αντίδρασης
Η χορήγηση των συστατικών της αντίδρασης σε δοχεία PCR ή πλάκες, αντίστοιχα, περιλαμβάνει πολλαπλές προκλήσεις που πρέπει να ξεπεραστούν:
Συνθήκες αντίδρασης
Η ακριβής και ακριβής δοσολογία των μεμονωμένων συστατικών είναι απαραίτητη όταν επιδιώκονται οι πιο πανομοιότυπες δυνατές συνθήκες αντίδρασης. Εκτός από μια καλή τεχνική πιπέτας, η επιλογή του σωστού εργαλείου είναι κρίσιμη. Τα κύρια μείγματα PCR συχνά περιέχουν ουσίες που αυξάνουν το ιξώδες ή δημιουργούν αφρό. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πιπέτας, αυτές οδηγούν σε σημαντική διαβροχή τουάκρες πιπέτας, μειώνοντας έτσι την ακρίβεια της πιπέτας. Η χρήση συστημάτων άμεσης διανομής ή εναλλακτικών ακροφυσίων πιπέτας που είναι λιγότερο επιρρεπή σε διαβροχή μπορεί να βελτιώσει την ακρίβεια και την ακρίβεια της διαδικασίας πιπέτας.
Μολύνσεις
Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χορήγησης, παράγονται αερολύματα τα οποία, εάν αφεθούν να φτάσουν στο εσωτερικό της πιπέτας, ενδέχεται να μολύνουν ένα άλλο δείγμα κατά το επόμενο βήμα της πιπέτας. Αυτό μπορεί να αποτραπεί με τη χρήση φίλτρων ή συστημάτων άμεσης εκτόπισης.
Αναλώσιμα όπωςσυμβουλέςΤα δοχεία και οι πλάκες που χρησιμοποιούνται στη ροή εργασίας PCR δεν πρέπει να περιέχουν ουσίες που θέτουν σε κίνδυνο το δείγμα ή παραποιούν το αποτέλεσμα. Σε αυτές περιλαμβάνονται το DNA, οι DNάσες, οι RNάσες και οι αναστολείς PCR, καθώς και συστατικά που ενδέχεται να διαρρεύσουν από το υλικό κατά τη διάρκεια της αντίδρασης – ουσίες γνωστές ως εκπλύσιμα.
Σφάλμα χρήστη
Όσο περισσότερα δείγματα υποβάλλονται σε επεξεργασία, τόσο υψηλότερος είναι ο κίνδυνος σφάλματος. Μπορεί εύκολα να συμβεί ένα δείγμα να διοχετευτεί με πιπέτα σε λάθος δοχείο ή σε λάθος φρεάτιο. Αυτός ο κίνδυνος μπορεί να μειωθεί σημαντικά με την εύκολα διακριτή σήμανση των φρεατίων. Μέσω της αυτοματοποίησης των βημάτων χορήγησης, ο «ανθρώπινος παράγοντας», δηλαδή τα σφάλματα και οι διακυμάνσεις που σχετίζονται με τον χρήστη, ελαχιστοποιούνται, αυξάνοντας έτσι την αναπαραγωγιμότητα, ειδικά στην περίπτωση μικρών όγκων αντίδρασης. Αυτό απαιτεί την χρήση πλακών επαρκούς διαστατικής σταθερότητας σε έναν σταθμό εργασίας. Οι συνδεδεμένοι γραμμωτοί κώδικες παρέχουν πρόσθετη αναγνωσιμότητα από μηχανήματα, η οποία απλοποιεί την παρακολούθηση των δειγμάτων σε όλη τη διαδικασία.
Προγραμματισμός του θερμοκυκλοποιητή
Ο προγραμματισμός ενός οργάνου μπορεί να αποδειχθεί χρονοβόρος και επιρρεπής σε σφάλματα. Διαφορετικά χαρακτηριστικά του θερμικού κυκλοποιητή PCR συνεργάζονται για να απλοποιήσουν αυτό το βήμα της διαδικασίας και, το πιο σημαντικό, να το κάνουν ασφαλές:
Η εύκολη λειτουργία και η καλή καθοδήγηση του χρήστη αποτελούν τη βάση του αποτελεσματικού προγραμματισμού. Βασιζόμενοι σε αυτό το θεμέλιο, η διαχείριση χρηστών με προστασία κωδικού πρόσβασης θα αποτρέψει την τροποποίηση των προγραμμάτων κάποιου από άλλους χρήστες. Εάν χρησιμοποιούνται πολλαπλοί ανακυκλωτές (του ίδιου τύπου), είναι ωφέλιμο ένα πρόγραμμα να μπορεί να μεταφερθεί απευθείας από το ένα όργανο στο άλλο μέσω USB ή συνδεσιμότητας. Το λογισμικό υπολογιστή επιτρέπει την κεντρική και ασφαλή διαχείριση προγραμμάτων, δικαιωμάτων χρήστη και εγγράφων σε έναν υπολογιστή.
Εκτέλεση PCR
Κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης, το DNA ενισχύεται στο δοχείο αντίδρασης, όπου κάθε δείγμα θα πρέπει να υποβάλλεται σε πανομοιότυπες, σταθερές συνθήκες αντίδρασης. Οι ακόλουθες πτυχές είναι σχετικές με τη διαδικασία:
Έλεγχος θερμοκρασίας
Η εξαιρετική ακρίβεια στον έλεγχο της θερμοκρασίας και η ομοιογένεια του μπλοκ κυκλοποίησης αποτελούν τη βάση για την ομοιόμορφη ρύθμιση της θερμοκρασίας όλων των δειγμάτων. Η υψηλή ποιότητα των στοιχείων θέρμανσης και ψύξης (στοιχεία Peltier), καθώς και ο τρόπος με τον οποίο αυτά συνδέονται με το μπλοκ, είναι οι καθοριστικοί παράγοντες που θα καθορίσουν τον κίνδυνο αποκλίσεων θερμοκρασίας, γνωστό ως «φαινόμενο ακμής».
Εξάτμιση
Οι συγκεντρώσεις των επιμέρους συστατικών της αντίδρασης δεν θα πρέπει να αλλάζουν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης λόγω εξάτμισης. Διαφορετικά, είναι πιθανό ότι πολύ λίγαΠροϊόν PCRμπορεί να παραχθεί ή καθόλου. Επομένως, είναι σημαντικό να ελαχιστοποιηθεί η εξάτμιση διασφαλίζοντας μια ασφαλή σφράγιση. Σε αυτήν την περίπτωση, το θερμαινόμενο καπάκι του θερμοκυκλοποιητή και η σφράγιση του δοχείου λειτουργούν άρρηκτα. Διατίθενται διαφορετικές επιλογές σφράγισης γιαΠλάκες PCR (σύνδεσμος: Άρθρο σφράγισης), όπου η καλύτερη σφράγιση επιτυγχάνεται μέσω θερμικής σφράγισης. Άλλα κλεισίματα μπορεί επίσης να είναι κατάλληλα, εφόσον η πίεση επαφής του καπακιού του ανακυκλωτή μπορεί να ρυθμιστεί στην επιλεγμένη σφράγιση.
Η τυποποίηση των διαδικασιών εφαρμόζεται προκειμένου να διασφαλιστούν ακριβή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα μακροπρόθεσμα. Αυτό περιλαμβάνει την τακτική συντήρηση του εξοπλισμού, ώστε να διασφαλίζεται ότι βρίσκεται πάντα σε καλή λειτουργική κατάσταση. Όλα τα αναλώσιμα θα πρέπει να είναι σταθερά υψηλής ποιότητας σε όλες τις παραγόμενες παρτίδες και η αξιόπιστη διαθεσιμότητά τους πρέπει να είναι εγγυημένη.
Ώρα δημοσίευσης: 29 Νοεμβρίου 2022