Standardisering af processer omfatter deres optimering og efterfølgende etablering og harmonisering, hvilket muliggør langsigtet optimal ydeevne – uafhængigt af brugeren. Standardisering sikrer resultater af høj kvalitet samt deres reproducerbarhed og sammenlignelighed.
Målet med (klassisk) PCR er at generere et pålideligt og reproducerbart resultat. For visse anvendelser er udbyttet afPCR-produkter også relevant. For disse reaktioner skal man være omhyggelig med at sikre, at prøverne ikke kompromitteres, og at PCR-workflowet forbliver stabilt. Specifikt betyder dette at minimere introduktionen af kontamineringer, der kan føre til falsk positive eller falsk negative resultater eller endda hæmme PCR-reaktionen. Desuden bør reaktionsbetingelserne være så identiske som muligt for hver enkelt prøve i en kørsel og også kunne overføres til efterfølgende reaktioner (med samme metode). Dette refererer til reaktionernes sammensætning samt typen af temperaturkontrol i cycleren. Brugerfejl skal naturligvis undgås så meget som muligt.
Nedenfor vil vi demonstrere de udfordringer, der opstår under forberedelsen og gennem hele PCR-forløbet – og de løsningsmetoder, der findes i forbindelse med instrumenter og forbrugsvarer, der anvendes til standardisering af PCR-arbejdsgangene.
Reaktionsforberedelse
Dispensering af reaktionskomponenter i henholdsvis PCR-beholdere eller -plader indebærer flere udfordringer, der skal overvindes:
Reaktionsbetingelser
Den nøjagtige og præcise dosering af de enkelte komponenter er uundværlig, når man sigter mod de mest identiske reaktionsbetingelser. Ud over en god pipetteringsteknik er valget af det rigtige værktøj afgørende. PCR-masterblandinger indeholder ofte stoffer, der øger viskositeten eller genererer skum. Under pipetteringsprocessen fører disse til betydelig befugtning afpipettespidser, hvilket reducerer pipetteringsnøjagtigheden. Brugen af direkte dispenseringssystemer eller alternative pipettespidser, der er mindre tilbøjelige til at blive befugtet, kan forbedre pipetteringsprocessens nøjagtighed og præcision.
Forureninger
Under dispenseringsprocessen genereres aerosoler, som, hvis de når ind i pipetten, potentielt kan kontaminere en anden prøve under det næste pipetteringstrin. Dette kan forhindres ved at bruge filterspidser eller direkte fortrængningssystemer.
Forbrugsvarer som f.eks.tipsBeholdere og plader, der anvendes i PCR-workflowet, må ikke indeholde stoffer, der kompromitterer prøven eller forfalsker resultatet. Disse omfatter DNA, DNaser, RNaser og PCR-hæmmere, samt komponenter, der potentielt kan udsives fra materialet under reaktionen – stoffer kendt som udvaskelige stoffer.
Brugerfejl
Jo flere prøver der behandles, desto højere er fejlrisikoen. Det kan nemt ske, at en prøve pipetteres i den forkerte beholder eller den forkerte brønd. Denne risiko kan reduceres betydeligt ved let synlig mærkning af brøndene. Gennem automatisering af dispenseringstrinnene minimeres den "menneskelige faktor", dvs. fejl og brugerrelaterede variationer, hvilket øger reproducerbarheden, især i tilfælde af små reaktionsvolumener. Dette kræver plader med tilstrækkelig dimensionsstabilitet, der kan anvendes i en arbejdsstation. Vedhæftede stregkoder giver yderligere maskinlæsbarhed, hvilket forenkler prøvesporing gennem hele processen.
Programmering af termocykleren
Programmering af et instrument kan vise sig at være tidskrævende og fejlbehæftet. Forskellige PCR-termocyklerfunktioner arbejder sammen for at forenkle dette procestrin og, vigtigst af alt, for at gøre det sikkert:
Nem betjening og god brugervejledning er grundlaget for effektiv programmering. Med udgangspunkt i dette fundament vil adgangskodebeskyttet brugeradministration forhindre, at ens egne programmer ændres af andre brugere. Hvis flere cyklusser (af samme type) er i brug, er det fordelagtigt, hvis et program kan overføres direkte fra et instrument til et andet via USB eller tilslutning. Computersoftware muliggør central og sikker administration af programmer, brugerrettigheder og dokumenter på en computer.
PCR-kørsel
Under kørslen amplificeres DNA i reaktionsbeholderen, hvor hver prøve skal underkastes identiske, ensartede reaktionsbetingelser. Følgende aspekter er relevante for processen:
Temperaturkontrol
Fremragende nøjagtighed i temperaturstyringen og homogenitet af cyclerblokken er grundlaget for en jævn temperaturbehandling af alle prøver. Den høje kvalitet af varme- og køleelementerne (peltier-elementer) samt den måde, hvorpå disse er forbundet til blokken, er de afgørende faktorer, der bestemmer risikoen for temperaturafvigelser, kendt som "kanteffekten".
Fordampning
Koncentrationerne af de enkelte reaktionskomponenter bør ikke ændre sig i løbet af reaktionen på grund af fordampning. Ellers er det muligt, at meget lidtPCR-produktkan genereres, eller slet ingen. Det er derfor afgørende at minimere fordampning ved at sikre en sikker forsegling. I dette tilfælde arbejder det opvarmede låg på termocykleren og beholderens forsegling hånd i hånd. Forskellige forseglingsmuligheder er tilgængelige forPCR-plader (link: Artikel om forsegling), hvorved den bedste forsegling opnås gennem varmeforsegling. Andre lukninger kan også være egnede, så længe kontakttrykket på cycler-låget kan justeres til den valgte forsegling.
Processtandardisering er på plads for at sikre nøjagtige og reproducerbare resultater på lang sigt. Dette inkluderer regelmæssig vedligeholdelse af udstyret for at sikre, at det altid er i god stand. Alle forbrugsvarer skal være af ensartet høj kvalitet på tværs af alle producerede partier, og deres pålidelige tilgængelighed skal garanteres.
Opslagstidspunkt: 29. november 2022