Standardiseringen av processer inkluderar deras optimering och efterföljande etablering och harmonisering, vilket möjliggör långsiktigt optimal prestanda – oberoende av användaren. Standardisering säkerställer högkvalitativa resultat, samt deras reproducerbarhet och jämförbarhet.
Målet med (klassisk) PCR är att generera ett tillförlitligt och reproducerbart resultat. För vissa tillämpningar är utbytet avPCR-produktär också relevant. För dessa reaktioner måste man vara noga med att säkerställa att proverna inte äventyras och att PCR-arbetsflödet förblir stabilt. Mer specifikt innebär detta att minimera införandet av kontamineringar som kan leda till falskt positiva eller falskt negativa resultat eller till och med hämma PCR-reaktionen. Dessutom bör reaktionsförhållandena vara så identiska som möjligt för varje enskilt prov inom en körning och även kunna överföras till efterföljande reaktioner (med samma metod). Detta hänvisar till reaktionernas sammansättning såväl som till typen av temperaturkontroll i cyklern. Användarfel ska naturligtvis undvikas så mycket som möjligt.
Nedan kommer vi att demonstrera de utmaningar som uppstår under förberedelserna och genom hela PCR-processen – och de lösningar som finns med avseende på instrument och förbrukningsvaror som används för standardisering av PCR-arbetsflödena.
Reaktionsberedning
Dispensering av reaktionskomponenter i PCR-kärl, respektive plattor, innebär flera utmaningar som måste övervinnas:
Reaktionsförhållanden
Exakt och precis dosering av de enskilda komponenterna är oumbärlig när man strävar efter så identiska reaktionsförhållanden som möjligt. Förutom en god pipetteringsteknik är det avgörande att välja rätt verktyg. PCR-mastermixer innehåller ofta ämnen som ökar viskositeten eller genererar skum. Under pipetteringsprocessen leder dessa till betydande vätning avpipettspetsar, vilket minskar pipetteringsnoggrannheten. Användningen av direkta dispenseringssystem eller alternativa pipettspetsar som är mindre benägna att vätas kan förbättra pipetteringsprocessens noggrannhet och precision.
Föroreningar
Under dispenseringsprocessen genereras aerosoler som, om de når pipettens insida, potentiellt kan kontaminera ett annat prov under nästa pipetteringssteg. Detta kan förhindras genom att använda filterspetsar eller direkta förträngningssystem.
Förbrukningsvaror som t.ex.tipsKärl och plattor som används i PCR-arbetsflödet får inte innehålla ämnen som äventyrar provet eller förfalskar resultatet. Dessa inkluderar DNA, DNaser, RNaser och PCR-hämmare, samt komponenter som potentiellt kan läcka ut från materialet under reaktionen – ämnen som kallas lakningsbara ämnen.
Användarfel
Ju fler prover som bearbetas, desto högre är felrisken. Det kan lätt hända att ett prov pipetteras i fel kärl eller fel brunn. Denna risk kan minskas avsevärt genom lätt urskiljbar märkning av brunnarna. Genom automatisering av dispenseringsstegen minimeras den "mänskliga faktorn", dvs. fel och användarrelaterade variationer, vilket ökar reproducerbarheten, särskilt vid små reaktionsvolymer. Detta kräver att plattor med tillräcklig dimensionsstabilitet används i en arbetsstation. Bifogade streckkoder ger ytterligare maskinläsbarhet, vilket förenklar provspårningen genom hela processen.
Programmering av termocyklern
Programmering av ett instrument kan visa sig vara tidskrävande och felbenäget. Olika PCR-termocyklerfunktioner samverkar för att förenkla detta processteg och, viktigast av allt, för att göra det säkert:
Enkel användning och god användarhandledning är grunden för effektiv programmering. Med denna grund i åtanke förhindrar lösenordsskyddad användaradministration att egna program ändras av andra användare. Om flera cykler (av samma typ) används är det fördelaktigt om ett program kan överföras direkt från ett instrument till ett annat via USB eller anslutning. Datorprogramvara möjliggör central och säker administration av program, användarrättigheter och dokument på en dator.
PCR-körning
Under körningen amplifieras DNA i reaktionskärlet, där varje prov ska utsättas för identiska, konsekventa reaktionsförhållanden. Följande aspekter är relevanta för processen:
Temperaturkontroll
Utmärkt noggrannhet i temperaturkontrollen och homogenitet i cyklerblocket är grunden för jämn temperaturkonditionering av alla prover. Den höga kvaliteten på värme- och kylelementen (peltierelement), liksom hur dessa är anslutna till blocket, är de avgörande faktorerna som avgör risken för temperaturavvikelser, så kallad "kanteffekt".
Indunstning
Koncentrationerna av de enskilda reaktionskomponenterna bör inte förändras under reaktionens gång på grund av avdunstning. Annars är det möjligt att mycket litePCR-produktkan genereras, eller ingen alls. Det är därför avgörande att minimera avdunstning genom att säkerställa en säker tätning. I detta fall samarbetar termocyklerns uppvärmda lock och kärlets tätning hand i hand. Olika tätningsalternativ finns tillgängliga förPCR-plattor (länk: Artikel om försegling), varvid den bästa tätningen uppnås genom värmeförsegling. Andra förslutningar kan också vara lämpliga, så länge kontakttrycket på cyklerlocket kan justeras till den valda tätningen.
Processstandardisering finns på plats för att säkerställa noggranna och reproducerbara resultat på lång sikt. Detta inkluderar regelbundet underhåll av utrustningen för att säkerställa att den alltid är i gott skick. Alla förbrukningsvaror ska vara av genomgående hög kvalitet i alla producerade partier, och deras tillförlitliga tillgänglighet måste garanteras.
Publiceringstid: 29 november 2022