Стандардизација процеса обухвата њихову оптимизацију и накнадно успостављање и хармонизацију, омогућавајући дугорочне оптималне перформансе – независно од корисника. Стандардизација обезбеђује висококвалитетне резултате, као и њихову поновљивост и упоредивост.
Циљ (класичне) ПЦР је добијање поузданог и репродуцибилног резултата. За одређене примене, приносПЦР производје такође релевантно. За ове реакције, мора се водити рачуна да се осигура да узорци нису угрожени и да ток рада ПЦР-а остане стабилан. Конкретно, ово се претвара у минимизирање уношења контаминација које би могле довести до лажно позитивних или лажно негативних резултата или чак инхибирати ПЦР реакцију. Штавише, услови реакције треба да буду што идентичнији за сваки појединачни узорак у оквиру једног циклуса и да се могу пренети на наредне реакције (исте методе). Ово се односи на састав реакција, као и на врсту контроле температуре у циклеру. Грешке корисника, наравно, треба избегавати колико год је то могуће.
У наставку ћемо показати изазове који се јављају током припреме и током целог извођења PCR анализе – и приступе решењима која постоје у погледу инструмената и потрошног материјала који се користе за стандардизацију PCR токова рада.
Припрема реакције
Дозирање реакционих компоненти у PCR посуде, односно плоче, подразумева вишеструке изазове које је потребно превазићи:
Услови реакције
Тачно и прецизно дозирање појединачних компоненти је неопходно када се теже постизању што идентичнијих реакционих услова. Поред добре технике пипетирања, избор правог алата је кључан. PCR мастер-миксеви често садрже супстанце које повећавају вискозност или стварају пену. Током процеса пипетирања, то доводи до значајног влажења...врхови пипета, чиме се смањује тачност пипетирања. Употреба система за директно дозирање или алтернативних врхова пипета који су мање склони влажењу може побољшати тачност и прецизност процеса пипетирања.
Контаминације
Током процеса дозирања, стварају се аеросоли који, ако им се дозволи да доспеју у унутрашњост пипете, могу потенцијално контаминирати други узорак током следећег корака пипетирања. Ово се може спречити употребом филтерских врхова или система за директно истискивање.
Потрошни материјал као што сусаветиПосуде и плоче које се користе у PCR току рада не смеју да садрже супстанце које угрожавају узорак или фалсификују резултат. То укључује ДНК, ДНазе, РНазе и PCR инхибиторе, као и компоненте које се потенцијално могу испражнити из материјала током реакције – супстанце познате као испражњиве супстанце.
Грешка корисника
Што се више узорака обрађује, већи је ризик од грешке. Лако се може десити да се узорак пипетира у погрешну посуду или погрешан бунар. Овај ризик се може знатно смањити лако уочљивим обележавањем бунара. Аутоматизацијом корака дозирања, „људски фактор“, тј. грешке и варијације повезане са корисником, минимизирају се, чиме се повећава репродуктивност, посебно у случају малих запремина реакције. Ово захтева плоче довољне димензионалне стабилности које се користе у радној станици. Причвршћени бар-кодови пружају додатну машинску читљивост, што поједностављује праћење узорка током целог процеса.
Програмирање термоциклера
Програмирање инструмента може бити дуготрајно, као и подложно грешкама. Различите карактеристике PCR термоциклера раде заједно како би поједноставиле овај корак процеса и, што је најважније, учиниле га безбедним:
Једноставно руковање и добро корисничко вођење су основа ефикасног програмирања. На основу овога, администрација корисника заштићена лозинком спречиће да други корисници мењају сопствене програме. Ако се користи више циклера (истог типа), корисно је ако се програм може директно пренети са једног инструмента на други путем УСБ-а или повезивања. Рачунарски софтвер омогућава централизовану и безбедну администрацију програма, корисничких права и докумената на рачунару.
ПЦР анализа
Током процеса, ДНК се амплификује у реакционој посуди, где сваки узорак треба да буде подвргнут идентичним, конзистентним реакционим условима. Следећи аспекти су релевантни за процес:
Контрола температуре
Одлична тачност у контроли температуре и хомогеност блока циклера су основа за равномерно температурно кондиционирање свих узорака. Висок квалитет грејних и расхладних елемената (Пелтиеови елементи), као и начин на који су повезани са блоком, су одлучујући фактори који ће одредити ризик од температурних одступања познатих као „ефекат ивице“.
Испаравање
Концентрације појединачних реакционих компоненти не би требало да се мењају током реакције због испаравања. У супротном, могуће је да се врло малоПЦР производможе се генерисати, или се уопште не генерише. Стога је кључно минимизирати испаравање осигуравањем сигурног заптивања. У овом случају, загрејани поклопац термоциклера и заптивач посуде раде руку под руку. Доступне су различите опције заптивања заПЦР плоче (линк: чланак о затварању), при чему се најбоље заптивање постиже термичким заптивањем. Други затварачи такође могу бити погодни, све док се контактни притисак поклопца циклера може подесити према одабраном заптивачу.
Стандардизација процеса је на снази како би се дугорочно осигурали тачни и поновљиви резултати. То укључује редовно одржавање опреме како би се осигурало да је увек у добром радном стању. Сав потрошни материјал треба да буде константно високог квалитета у свим произведеним серијама, а њихова поуздана доступност мора бити загарантована.
Време објаве: 29. новембар 2022.