Стандартизация процессов включает их оптимизацию и последующее установление и гармонизацию, что позволяет долгосрочную оптимальную производительность – независимо от пользователя. Стандартизация обеспечивает высококачественные результаты, а также их воспроизводимость и сопоставимость.
Целью (классической) ПЦР является получение надежного и воспроизводимого результата. Для некоторых приложений выходПЦР-продукттакже имеет значение. Для этих реакций необходимо позаботиться о том, чтобы образцы не были скомпрометированы и чтобы рабочий процесс ПЦР оставался стабильным. В частности, это означает минимизацию внесения загрязнений, которые могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам или даже затормозить реакцию ПЦР. Кроме того, условия реакции должны быть максимально идентичными для каждого отдельного образца в ходе запуска, а также переносимыми на последующие реакции (того же метода). Это относится к составу реакций, а также к типу контроля температуры в циклере. Ошибок пользователя, конечно, следует избегать, насколько это возможно.
Ниже мы продемонстрируем проблемы, возникающие во время подготовки и проведения ПЦР, а также подходы к их решению, которые существуют в отношении инструментов и расходных материалов, используемых для стандартизации рабочих процессов ПЦР.
Подготовка реакции
Распределение компонентов реакции в ПЦР-сосуды или планшеты соответственно связано с рядом проблем, которые необходимо преодолеть:
Условия реакции
Точное и аккуратное дозирование отдельных компонентов необходимо, когда вы стремитесь к максимально идентичным условиям реакции. Помимо хорошей техники пипетирования, критически важен выбор правильного инструмента. Мастер-миксы ПЦР часто содержат вещества, которые увеличивают вязкость или образуют пену. В процессе пипетирования они приводят к существенному смачиваниюнаконечники пипеток, что снижает точность пипетирования. Использование систем прямого дозирования или альтернативных наконечников пипеток, которые менее склонны к смачиванию, может повысить точность и правильность процесса пипетирования.
Загрязнения
В процессе дозирования образуются аэрозоли, которые, если им позволить попасть внутрь пипетки, могут потенциально загрязнить другой образец на следующем этапе пипетирования. Этого можно избежать, используя фильтрующие наконечники или системы прямого вытеснения.
Расходные материалы, такие каксоветы, сосуды и планшеты, которые используются в рабочем процессе ПЦР, не должны содержать веществ, которые могут испортить образец или фальсифицировать результат. К ним относятся ДНК, ДНКазы, РНКазы и ингибиторы ПЦР, а также компоненты, которые могут потенциально выщелачиваться из материала во время реакции — вещества, известные как выщелачиваемые.
Ошибка пользователя
Чем больше образцов обрабатывается, тем выше риск ошибки. Легко может случиться, что образец пипетируется в неправильный сосуд или неправильную лунку. Этот риск можно значительно снизить, легко различимым обозначением лунок. Благодаря автоматизации этапов дозирования «человеческий фактор», т. е. ошибки и вариации, связанные с пользователем, сводятся к минимуму, тем самым повышая воспроизводимость, особенно в случае небольших объемов реакции. Для этого на рабочей станции необходимо использовать планшеты с достаточной размерной стабильностью. Прикрепленные штрихкоды обеспечивают дополнительную машиночитаемость, что упрощает отслеживание образцов на протяжении всего процесса.
Программирование термоциклера
Программирование инструмента может оказаться трудоемким и подверженным ошибкам. Различные функции термоциклера ПЦР работают вместе, чтобы упростить этот этап процесса и, что самое важное, сделать его безопасным:
Простота эксплуатации и хорошее руководство пользователя являются основой эффективного программирования. Основываясь на этой основе, защищенное паролем управление пользователями предотвратит изменение собственных программ другими пользователями. Если используется несколько циклеров (одного типа), будет полезно, если программу можно будет напрямую переносить с одного прибора на другой через USB или соединение. Программное обеспечение компьютера обеспечивает централизованное и безопасное администрирование программ, прав пользователей и документов на компьютере.
ПЦР-прогон
Во время запуска ДНК амплифицируется в реакционном сосуде, где каждый образец должен подвергаться идентичным, постоянным условиям реакции. Следующие аспекты имеют значение для процесса:
Контроль температуры
Отличная точность контроля температуры и однородность блока циклера являются основой для равномерного температурного кондиционирования всех образцов. Высокое качество нагревательных и охлаждающих элементов (элементов Пельтье), а также способ их подключения к блоку являются решающими факторами, которые определяют риск температурных расхождений, известных как «эффект края»
Испарение
Концентрации отдельных компонентов реакции не должны изменяться в ходе реакции из-за испарения. В противном случае возможно, что очень малоПЦР-продуктможет быть сгенерировано или не сгенерировано вообще. Поэтому крайне важно минимизировать испарение, обеспечив надежную герметизацию. В этом случае нагретая крышка термоциклера и герметизация сосуда работают рука об руку. Доступны различные варианты герметизации дляПланшеты ПЦР (ссылка: статья «Запечатывание»), при этом наилучшее уплотнение достигается посредством термосварки. Другие способы закрытия также могут быть подходящими, при условии, что контактное давление крышки циклера можно отрегулировать в соответствии с выбранным уплотнением.
Стандартизация процесса осуществляется для обеспечения точных и воспроизводимых результатов в долгосрочной перспективе. Это включает в себя регулярное обслуживание оборудования для обеспечения его постоянного хорошего рабочего состояния. Все расходные материалы должны быть неизменно высокого качества во всех произведенных партиях, а их надежная доступность должна быть гарантирована.
Время публикации: 29-11-2022