A padronização de processos inclui sua otimização e subsequente estabelecimento e harmonização, permitindo um desempenho ótimo a longo prazo – independentemente do usuário. A padronização garante resultados de alta qualidade, bem como sua reprodutibilidade e comparabilidade.
O objetivo da PCR (clássica) é gerar um resultado confiável e reprodutível. Para certas aplicações, o rendimento doproduto de PCRtambém é relevante. Para essas reações, deve-se tomar cuidado para garantir que as amostras não sejam comprometidas e que o fluxo de trabalho da PCR permaneça estável. Especificamente, isso se traduz em minimizar a introdução de contaminações que possam levar a resultados falso-positivos ou falso-negativos ou até mesmo inibir a reação da PCR. Além disso, as condições da reação devem ser o mais idênticas possível para cada amostra individual dentro de uma corrida e também ser transferíveis para reações subsequentes (do mesmo método). Isso se refere à composição das reações, bem como ao tipo de controle de temperatura no ciclador. Erros do usuário, é claro, devem ser evitados o máximo possível.
Abaixo, demonstraremos os desafios encontrados durante a preparação e durante toda a execução de uma PCR – e as abordagens para soluções que existem com relação aos instrumentos e consumíveis usados para a padronização dos fluxos de trabalho de PCR.
Preparação da reação
A distribuição de componentes de reação em recipientes de PCR, ou placas, respectivamente, envolve vários desafios que devem ser superados:
Condições de reação
A dosagem exata e precisa dos componentes individuais é indispensável para atingir as condições de reação mais idênticas possíveis. Além de uma boa técnica de pipetagem, a seleção da ferramenta correta é fundamental. As master-mixes para PCR frequentemente contêm substâncias que aumentam a viscosidade ou geram espuma. Durante o processo de pipetagem, estas substâncias causam um molhamento substancial do material.pontas de pipeta, reduzindo assim a precisão da pipetagem. O uso de sistemas de dispensação direta ou ponteiras alternativas, menos propensas a molhar, pode melhorar a precisão e a exatidão do processo de pipetagem.
Contaminações
Durante o processo de dispensação, são gerados aerossóis que, se atingirem o interior da pipeta, podem contaminar outra amostra na próxima etapa de pipetagem. Isso pode ser evitado com o uso de pontas com filtro ou sistemas de deslocamento direto.
Consumíveis comopontasOs recipientes e placas utilizados no fluxo de trabalho de PCR não devem conter substâncias que comprometam a amostra ou falsifiquem o resultado. Isso inclui DNA, DNases, RNases e inibidores de PCR, bem como componentes que possam potencialmente ser lixiviados do material durante a reação – substâncias conhecidas como lixiviáveis.
Erro do usuário
Quanto mais amostras são processadas, maior o risco de erro. É fácil que uma amostra seja pipetada para o recipiente ou poço errado. Esse risco pode ser consideravelmente reduzido pela marcação facilmente perceptível dos poços. Através da automação das etapas de dispensação, o "fator humano", ou seja, erros e variações relacionadas ao usuário, são minimizados, aumentando assim a reprodutibilidade, especialmente no caso de pequenos volumes de reação. Isso requer placas com estabilidade dimensional suficiente para serem utilizadas em uma estação de trabalho. Códigos de barras anexados proporcionam legibilidade adicional por máquina, o que simplifica o rastreamento da amostra ao longo de todo o processo.
Programação do termociclador
Programar um instrumento pode ser demorado e propenso a erros. Diferentes recursos do termociclador de PCR trabalham em conjunto para simplificar essa etapa do processo e, principalmente, torná-la segura:
A operação fácil e a boa orientação ao usuário são a base de uma programação eficiente. Com base nisso, a administração de usuários protegida por senha impedirá que os próprios programas sejam alterados por outros usuários. Se vários cicladores (do mesmo tipo) estiverem em uso, é vantajoso que um programa possa ser transferido diretamente de um instrumento para outro via USB ou conectividade. O software de computador permite a administração centralizada e segura de programas, direitos de usuário e documentos em um computador.
Execução de PCR
Durante a corrida, o DNA é amplificado no recipiente de reação, onde cada amostra deve ser submetida a condições de reação idênticas e consistentes. Os seguintes aspectos são relevantes para o processo:
Controle de temperatura
A excelente precisão no controle de temperatura e a homogeneidade do bloco ciclador são a base para o condicionamento uniforme da temperatura de todas as amostras. A alta qualidade dos elementos de aquecimento e resfriamento (elementos Peltier), bem como a forma como estes são conectados ao bloco, são os fatores decisivos que determinarão o risco de discrepâncias de temperatura, conhecido como "efeito de borda".
Evaporação
As concentrações dos componentes individuais da reação não devem mudar ao longo da reação devido à evaporação. Caso contrário, é possível que muito poucoproduto de PCRpode ser gerada, ou mesmo nenhuma. Portanto, é crucial minimizar a evaporação, garantindo uma vedação segura. Neste caso, a tampa aquecida do termociclador e a vedação do recipiente trabalham em conjunto. Diferentes opções de vedação estão disponíveis paraPlacas de PCR (link: artigo sobre selagem), onde a melhor vedação é obtida por meio de selagem a quente. Outros fechamentos também podem ser adequados, desde que a pressão de contato da tampa do ciclador possa ser ajustada à vedação selecionada.
A padronização dos processos visa garantir resultados precisos e reprodutíveis a longo prazo. Isso inclui a manutenção regular dos equipamentos para garantir que estejam sempre em boas condições de funcionamento. Todos os consumíveis devem apresentar alta qualidade consistente em todos os lotes produzidos, e sua disponibilidade confiável deve ser garantida.
Horário da publicação: 29/11/2022