Standaryzacja procesów obejmuje ich optymalizację, a następnie ustanowienie i harmonizację, umożliwiając długoterminową optymalną wydajność – niezależnie od użytkownika. Standaryzacja zapewnia wysokiej jakości wyniki, a także ich powtarzalność i porównywalność.
Celem (klasycznej) reakcji PCR jest uzyskanie wiarygodnego i powtarzalnego wyniku. W przypadku niektórych zastosowań wydajnośćProdukt PCRjest również istotne. W przypadku tych reakcji należy zadbać o to, aby próbki nie zostały naruszone, a przepływ pracy PCR pozostał stabilny. W szczególności oznacza to minimalizację wprowadzania zanieczyszczeń, które mogłyby prowadzić do wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych, a nawet zahamować reakcję PCR. Ponadto warunki reakcji powinny być jak najbardziej identyczne dla każdej pojedynczej próbki w ramach cyklu, a także powinny być przenoszone na kolejne reakcje (tej samej metody). Dotyczy to zarówno składu reakcji, jak i rodzaju kontroli temperatury w cyklerze. Błędów użytkownika należy oczywiście unikać w jak największym stopniu.
Poniżej przedstawimy wyzwania, na jakie napotykamy podczas przygotowania i przebiegu PCR, a także podejścia do rozwiązań, które istnieją w odniesieniu do urządzeń i materiałów eksploatacyjnych wykorzystywanych do standaryzacji przepływów pracy PCR.
Przygotowanie reakcji
Dozowanie składników reakcji do naczyń PCR lub płytek wiąże się z wieloma wyzwaniami, które należy pokonać:
Warunki reakcji
Dokładne i precyzyjne dozowanie poszczególnych składników jest niezbędne, gdy dąży się do uzyskania możliwie najbardziej identycznych warunków reakcji. Oprócz dobrej techniki pipetowania, kluczowe znaczenie ma dobór właściwego narzędzia. Mastermiksy PCR często zawierają substancje, które zwiększają lepkość lub wytwarzają pianę. Podczas procesu pipetowania prowadzi to do znacznego zwilżaniakońcówki pipet, co zmniejsza dokładność pipetowania. Zastosowanie systemów dozowania bezpośredniego lub alternatywnych końcówek pipet, które są mniej podatne na zwilżanie, może poprawić dokładność i precyzję procesu pipetowania.
Zanieczyszczenia
Podczas procesu dozowania powstają aerozole, które, jeśli dostaną się do wnętrza pipety, mogą potencjalnie zanieczyścić inną próbkę podczas następnego etapu pipetowania. Można temu zapobiec, stosując końcówki filtrujące lub systemy bezpośredniego przemieszczania.
Materiały eksploatacyjne takie jakporady, naczynia i płytki używane w procesie PCR nie mogą zawierać substancji, które mogą uszkodzić próbkę lub zafałszować wynik. Należą do nich DNA, DNazy, RNazy i inhibitory PCR, a także składniki, które mogą potencjalnie wypłukiwać się z materiału podczas reakcji – substancje znane jako substancje wymywalne.
Błąd użytkownika
Im więcej próbek jest przetwarzanych, tym większe ryzyko błędu. Może się łatwo zdarzyć, że próbka zostanie odpipetowana do niewłaściwego naczynia lub niewłaściwego dołka. Ryzyko to można znacznie zmniejszyć, stosując łatwo dostrzegalne oznaczenia dołków. Dzięki automatyzacji etapów dozowania „czynnik ludzki”, tj. błędy i odchylenia związane z użytkownikiem, są minimalizowane, zwiększając w ten sposób powtarzalność, zwłaszcza w przypadku małych objętości reakcji. Wymaga to płytek o wystarczającej stabilności wymiarowej, które mają być stosowane na stanowisku roboczym. Dołączone kody kreskowe zapewniają dodatkową czytelność maszynową, co upraszcza śledzenie próbek w całym procesie.
Programowanie termocyklera
Programowanie instrumentu może okazać się czasochłonne, a także podatne na błędy. Różne funkcje termocyklera PCR współpracują ze sobą, aby uprościć ten etap procesu i, co najważniejsze, uczynić go bezpiecznym:
Łatwa obsługa i dobre wskazówki dla użytkownika są podstawą efektywnego programowania. Opierając się na tym fundamencie, chroniona hasłem administracja użytkownikami zapobiegnie zmianie własnych programów przez innych użytkowników. Jeśli używanych jest wiele cyklerów (tego samego typu), korzystne jest, aby program można było przenieść bezpośrednio z jednego instrumentu do drugiego za pośrednictwem USB lub łączności. Oprogramowanie komputerowe umożliwia centralne i bezpieczne administrowanie programami, prawami użytkownika i dokumentami na komputerze.
Przebieg PCR
Podczas przebiegu DNA jest amplifikowane w naczyniu reakcyjnym, gdzie każda próbka powinna być poddana identycznym, spójnym warunkom reakcji. Następujące aspekty są istotne dla procesu:
Kontrola temperatury
Doskonała dokładność kontroli temperatury i jednorodność bloku cyklera są podstawą równomiernego kondycjonowania temperaturowego wszystkich próbek. Wysoka jakość elementów grzewczych i chłodzących (elementów Peltiera), a także sposób, w jaki są one połączone z blokiem, są decydującymi czynnikami, które określą ryzyko rozbieżności temperaturowych znanych jako „efekt krawędziowy”
Odparowanie
Stężenia poszczególnych składników reakcji nie powinny zmieniać się w trakcie reakcji z powodu parowania. W przeciwnym razie możliwe jest, że bardzo niewieleProdukt PCRmogą być generowane lub nie mogą być generowane wcale. Dlatego też kluczowe jest zminimalizowanie parowania poprzez zapewnienie bezpiecznego uszczelnienia. W tym przypadku podgrzewana pokrywa termocyklera i uszczelnienie naczynia współpracują ze sobą. Dostępne są różne opcje uszczelnieniaPłytki PCR (link: Artykuł o uszczelnianiu), gdzie najlepsze uszczelnienie uzyskuje się poprzez zgrzewanie termiczne. Inne zamknięcia mogą być również odpowiednie, o ile nacisk kontaktowy pokrywy cyklera można dostosować do wybranego uszczelnienia.
Standaryzacja procesu jest stosowana w celu zabezpieczenia dokładnych i powtarzalnych wyników w długim okresie. Obejmuje to regularną konserwację sprzętu, aby zapewnić, że zawsze jest w dobrym stanie technicznym. Wszystkie materiały eksploatacyjne powinny być niezmiennie wysokiej jakości we wszystkich wyprodukowanych partiach, a ich niezawodna dostępność musi być gwarantowana.
Czas publikacji: 29-11-2022