За успешни реакции на амплификација, потребно е поединечните компоненти на реакцијата да бидат присутни во точната концентрација во секој препарат. Покрај тоа, важно е да не се појави контаминација.
Особено кога треба да се постават многу реакции, воспоставено е да се подготви таканаречена главна мешавина наместо да се пипетира секој реагенс одделно во секој сад. Комерцијално достапни се претходно конфигурирани мешавини, во кои се додаваат само компоненти специфични за примерокот (прајмер) и вода. Алтернативно, главната мешавина може да ја подготвите сами. Во обете варијанти, смесата се дистрибуира во секој PCR сад без шаблон, а индивидуалниот примерок на ДНК се додава одделно на крајот.
Користењето на мастер микс има неколку предности: Прво, се намалува бројот на единечни чекори на пипетирање. На овој начин, се минимизираат и ризикот од грешки на корисникот за време на пипетирањето и ризикот од контаминација и, секако, се заштедува време. Во принцип, точноста на пипетирањето е исто така поголема, бидејќи се дозираат поголеми волумени. Ова е лесно да се разбере при проверка на техничките податоци на пипетите: Колку е помал дозираниот волумен, толку се поголеми можат да бидат отстапувањата. Фактот дека сите препарати доаѓаат од ист сад има позитивен ефект врз хомогеноста (доколку се добро измешани). Ова исто така ја подобрува репродуктивноста на експериментите.
При подготовка на главната смеса, треба да се додаде најмалку 10% дополнителен волумен (на пр., ако се потребни 10 препарати, пресметајте врз основа на 11), така што дури и последниот сад ќе се наполни правилно. На овој начин, може да се компензираат (малите) неточности при пипетирање и ефектот од губење на примерокот при дозирање на раствори што содржат детергент. Детергентите се содржани во ензимски раствори како што се полимеразите и главните смеси, предизвикувајќи формирање на пена и остатоци на внатрешната површина на нормалните...врвови на пипета.
Во зависност од примената и видот на течноста што треба да се дозира, треба да се избере правилната техника на пипетирање (1) и соодветната опрема. За раствори што содржат детергенти, се препорачува систем за директно поместување или таканаречени врвови на пипети со „ниско задржување“ како алтернатива на пипетите со воздушно перниче. Ефектот наВрв на пипета ACEсе базира на особено хидрофобна површина. Течностите што содржат детергенти не оставаат филм за остатоци одвнатре и однадвор, така што губењето на растворот може да се минимизира.
Освен точното дозирање на сите компоненти, важно е и да не се појави контаминација на препаратите. Не е доволно да се користат потрошни материјали со висока чистота, бидејќи процесот на пипетирање во пипета со воздушна перница може да произведе аеросоли што остануваат во пипетата. ДНК-та што може да се содржи во аеросолот може да се пренесе од еден примерок на друг во следниот чекор на пипетирање и на тој начин да доведе до контаминација. Системите за директно поместување споменати погоре, исто така, можат да го минимизираат овој ризик. За пипети со воздушна перница, има смисла да се користат врвови на филтерот за да се заштити конусот на пипетата со задржување на прскања, аеросоли и биомолекули.
Време на објавување: 06.12.2022