Procesu standartizācija ietver to optimizāciju un sekojošu ieviešanu un saskaņošanu, ļaujot ilgtermiņā panākt optimālu veiktspēju – neatkarīgi no lietotāja. Standartizācija nodrošina augstas kvalitātes rezultātus, kā arī to reproducējamību un salīdzināmību.
(Klasiskās) PCR mērķis ir iegūt uzticamu un reproducējamu rezultātu. Dažos gadījumos ražība var būtPCR produktsir arī svarīgi. Šajās reakcijās jārūpējas, lai paraugi netiktu apdraudēti un PCR darbplūsma paliktu stabila. Konkrēti, tas nozīmē samazināt piesārņojuma iekļūšanu, kas varētu izraisīt viltus pozitīvus vai viltus negatīvus rezultātus vai pat kavēt PCR reakciju. Turklāt reakcijas apstākļiem jābūt pēc iespējas identiskiem katram atsevišķam paraugam vienas reakcijas ietvaros, kā arī pārnesamiem uz nākamajām reakcijām (ar to pašu metodi). Tas attiecas gan uz reakciju sastāvu, gan uz temperatūras kontroles veidu ciklerā. Protams, pēc iespējas jāizvairās no lietotāja kļūdām.
Tālāk mēs parādīsim izaicinājumus, ar kuriem saskaras PĶR sagatavošanas laikā un visā tās gaitā, kā arī risinājumu pieejas, kas pastāv attiecībā uz instrumentiem un palīgmateriāliem, ko izmanto PĶR darbplūsmu standartizēšanai.
Reakcijas sagatavošana
Reakcijas komponentu ievadīšana PCR traukos vai attiecīgi plāksnēs rada vairākas problēmas, kas jāpārvar:
Reakcijas apstākļi
Precīza un atsevišķo komponentu dozēšana ir neaizstājama, lai panāktu pēc iespējas identiskākus reakcijas apstākļus. Papildus labai pipetēšanas tehnikai ir ļoti svarīga arī pareizā instrumenta izvēle. PCR galvenie maisījumi bieži satur vielas, kas palielina viskozitāti vai rada putas. Pipetēšanas procesa laikā tās ievērojami samitrina preparātu.pipetes uzgaļi, tādējādi samazinot pipetēšanas precizitāti. Tiešās dozēšanas sistēmu vai alternatīvu pipetes uzgaļu, kas ir mazāk pakļauti mitrināšanai, izmantošana var uzlabot pipetēšanas procesa precizitāti un precizitāti.
Piesārņojumi
Dozēšanas procesā rodas aerosoli, kas, nonākot pipetes iekšpusē, nākamās pipetēšanas darbības laikā var potenciāli piesārņot citu paraugu. To var novērst, izmantojot filtra uzgaļus vai tiešās pārvietošanas sistēmas.
Palīgmateriāli, piemēram,padomiPCR darbplūsmā izmantotie trauki un plāksnes nedrīkst saturēt vielas, kas apdraud paraugu vai vilto rezultātu. Pie tām pieder DNS, DNāzes, RNāzes un PCR inhibitori, kā arī komponenti, kas reakcijas laikā var izskaloties no materiāla – vielas, kas pazīstamas kā izskalojamas vielas.
Lietotāja kļūda
Jo vairāk paraugu tiek apstrādāts, jo lielāks kļūdu risks. Var viegli gadīties, ka paraugs tiek pipetēts nepareizā traukā vai nepareizajā iedobē. Šo risku var ievērojami samazināt, viegli saskatot iedobju marķējumu. Automatizējot dozēšanas darbības, tiek samazināts "cilvēciskais faktors", t. i., kļūdas un ar lietotāju saistītas variācijas, tādējādi palielinot atkārtojamību, īpaši nelielu reakcijas tilpumu gadījumā. Šim nolūkam darbstacijā ir jāizmanto plāksnes ar pietiekamu izmēru stabilitāti. Pievienotie svītrkodi nodrošina papildu mašīnlasāmību, kas vienkāršo paraugu izsekošanu visā procesā.
Termociklera programmēšana
Instrumenta programmēšana var izrādīties laikietilpīga, kā arī kļūdu riskanta. Dažādas PCR termociklera funkcijas darbojas kopā, lai vienkāršotu šo procesa soli un, pats galvenais, padarītu to drošu:
Vienkārša lietošana un laba lietotāja vadība ir efektīvas programmēšanas pamatā. Balstoties uz to, ar paroli aizsargāta lietotāju administrēšana neļaus citiem lietotājiem mainīt savas programmas. Ja tiek izmantoti vairāki (viena veida) cikleri, ir izdevīgi, ja programmu var tieši pārsūtīt no viena instrumenta uz citu, izmantojot USB vai savienojumu. Datorprogrammatūra nodrošina centralizētu un drošu programmu, lietotāju tiesību un dokumentu administrēšanu datorā.
PCR skrējiens
Darbības laikā DNS tiek amplificēta reakcijas traukā, kur katrs paraugs jāpakļauj identiskiem, konsekventiem reakcijas apstākļiem. Procesam ir svarīgi šādi aspekti:
Temperatūras kontrole
Lieliska temperatūras kontroles precizitāte un ciklera bloka homogenitāte ir visu paraugu vienmērīgas temperatūras kondicionēšanas pamatā. Sildīšanas un dzesēšanas elementu (Peltjē elementu) augstā kvalitāte, kā arī veids, kā tie ir savienoti ar bloku, ir izšķirošie faktori, kas noteiks temperatūras neatbilstību risku, kas pazīstams kā "malas efekts".
Iztvaikošana
Atsevišķu reakcijas komponentu koncentrācijām reakcijas gaitā nevajadzētu mainīties iztvaikošanas dēļ. Pretējā gadījumā ir iespējams, ka ļoti mazPCR produktsvar rasties vai arī neradīties vispār. Tāpēc ir svarīgi samazināt iztvaikošanu, nodrošinot drošu blīvējumu. Šajā gadījumā termociklera apsildāmais vāks un trauka blīvējums darbojas roku rokā. Ir pieejamas dažādas blīvēšanas iespējasPCR plāksnes (saite: Raksts par blīvēšanu), kur labākais blīvējums tiek panākts, izmantojot karstumizturīgu blīvēšanu. Var būt piemēroti arī citi aizbāžņi, ja vien ciklera vāka saskares spiedienu var pielāgot izvēlētajam blīvējumam.
Lai ilgtermiņā nodrošinātu precīzus un reproducējamus rezultātus, ir ieviesta procesa standartizācija. Tas ietver regulāru iekārtu apkopi, lai nodrošinātu to vienmēr labu darba stāvokli. Visiem palīgmateriāliem visās saražotajās partijās ir jābūt nemainīgi augstas kvalitātes, un ir jāgarantē to uzticama pieejamība.
Publicēšanas laiks: 2022. gada 29. novembris