הסטנדרטיזציה של תהליכים כוללת אופטימיזציה שלהם, ביסוסם והרמוניזציה לאחר מכן, המאפשרת ביצועים אופטימליים לטווח ארוך - ללא תלות במשתמש. הסטנדרטיזציה מבטיחה תוצאות באיכות גבוהה, כמו גם יכולת שחזור והשוואה.
מטרת ה-PCR (הקלאסי) היא יצירת תוצאה אמינה וניתנת לשחזור. עבור יישומים מסוימים, התשואה שלמוצר PCRרלוונטי גם כן. עבור תגובות אלו, יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שהדגימות לא יפגעו ושתהליך העבודה של ה-PCR יישאר יציב. באופן ספציפי, זה מתבטא במזעור החדרת זיהומים שעלולים להוביל לתוצאות חיוביות שגויות או שליליות שגויות או אפילו לעכב את תגובת ה-PCR. יתר על כן, תנאי התגובה צריכים להיות זהים ככל האפשר עבור כל דגימה בנפרד בתוך ריצה וגם להיות ניתנים להעברה לתגובות עוקבות (מאותה שיטה). זה מתייחס להרכב התגובות וכן לסוג בקרת הטמפרטורה במחזור. כמובן שיש להימנע מטעויות משתמש ככל האפשר.
להלן, נדגים את האתגרים בהם נתקלים במהלך ההכנה ולאורך כל תהליך ה-PCR - ואת הגישות לפתרונות הקיימות ביחס למכשירים ולחומרים מתכלים המשמשים לסטנדרטיזציה של זרימות עבודה של ה-PCR.
הכנת תגובה
החדרת רכיבי התגובה לכלי PCR, או פלטות, בהתאמה, כרוכה במספר אתגרים שיש להתגבר עליהם:
תנאי תגובה
מינון מדויק ומדויק של הרכיבים השונים הוא הכרחי כשמכוונים לתנאי תגובה זהים ככל האפשר. בנוסף לטכניקת פיפטה טובה, בחירת הכלי הנכון היא קריטית. תערובות אב של PCR מכילות לעתים קרובות חומרים המגבירים את הצמיגות או יוצרים קצף. במהלך תהליך הפיפטה, אלה מובילים להרטבה משמעותית של...טיפים לפיפטה, ובכך מפחית את דיוק הפיפטה. השימוש במערכות דיוור ישיר או בקצוות פיפטה חלופיים הנוטים פחות להרטבה יכול לשפר את הדיוק והדיוק של תהליך הפיפטה.
זיהומים
במהלך תהליך ההפצה נוצרים אירוסולים אשר, אם יורשו להגיע לחלק הפנימי של הפיפטה, עלולים לזהם דגימה אחרת במהלך שלב הפיפטה הבא. ניתן למנוע זאת באמצעות שימוש בקצוות סינון או במערכות הזזה ישירה.
חומרים מתכלים כגוןטיפיםמכלים ולוחות המשמשים בתהליך העבודה של ה-PCR אינם חייבים להכיל חומרים אשר פוגעים בדגימה או מזייפים את התוצאה. אלה כוללים DNA, DNases, RNases ומעכבי PCR, כמו גם רכיבים אשר עלולים לדלוף מהחומר במהלך התגובה - חומרים המכונים חומרים ניתנים לדליפה.
שגיאת משתמש
ככל שמעובדים יותר דגימות, כך הסיכון לשגיאות גבוה יותר. בקלות יכול לקרות שדגימה מוכנסת לכלי הלא נכון או לבאר הלא נכון. ניתן להפחית סיכון זה באופן משמעותי על ידי סימון קל של הבארות. באמצעות אוטומציה של שלבי ההפצה, "הגורם האנושי", כלומר שגיאות ווריאציות הקשורות למשתמש, ממוזער, ובכך מגביר את יכולת השחזור, במיוחד במקרה של נפחי תגובה קטנים. זה דורש שימוש בלוחות בעלי יציבות ממדית מספקת בתחנת עבודה. ברקודים מחוברים מספקים קריאות מכונה נוספת, מה שמפשט את מעקב הדגימות לאורך כל התהליך.
תכנות התרמוציקלר
תכנות מכשיר יכול להיות גוזל זמן וגם מועד לטעויות. תכונות שונות של ציקל תרמי PCR פועלות יחד כדי לפשט את שלב התהליך הזה, וחשוב מכל, כדי להפוך אותו לבטוח:
הפעלה קלה והדרכת משתמש טובה הם הבסיס לתכנות יעיל. בהתבסס על בסיס זה, ניהול משתמשים המוגן בסיסמה ימנע שינוי של התוכניות של המשתמש על ידי משתמשים אחרים. אם משתמשים במספר מכשירי מחזור (מאותו סוג), כדאי להעביר תוכנית ישירות ממכשיר אחד לאחר באמצעות USB או קישוריות. תוכנת מחשב מאפשרת ניהול מרכזי ומאובטח של תוכניות, הרשאות משתמש ומסמכים במחשב.
ריצת PCR
במהלך הריצה, ה-DNA מוגבר בכלי התגובה, כאשר כל דגימה צריכה להיות נתונה לתנאי תגובה זהים ועקביים. ההיבטים הבאים רלוונטיים לתהליך:
בקרת טמפרטורה
דיוק מעולה בבקרת טמפרטורה והומוגניות של בלוק המחזור הם הבסיס להתאמה אחידה של כל הדגימות. האיכות הגבוהה של אלמנטי החימום והקירור (אלמנטי פלטייה), כמו גם האופן שבו הם מחוברים לבלוק, הם הגורמים המכריעים שיקבעו את הסיכון לפערים בטמפרטורה המכונים "אפקט הקצה".
הִתאַדוּת
ריכוזי רכיבי התגובה השונים לא אמורים להשתנות במהלך התגובה עקב אידוי. אחרת, ייתכן שריכוזים מעטים מאודמוצר PCRעשוי להיווצר, או בכלל לא. לכן חיוני למזער אידוי על ידי הבטחת אטימה בטוחה. במקרה זה, המכסה המחומם של התרמוציקלר ואיטום הכלי פועלים יד ביד. אפשרויות איטום שונות זמינות עבורפלטות PCR (קישור: מאמר על איטום), לפיה האיטום הטוב ביותר מושג באמצעות איטום בחום. סגירות אחרות עשויות גם הן להתאים, כל עוד ניתן להתאים את לחץ המגע של מכסה המכונה לאיטום הנבחר.
סטנדרטיזציה של תהליכים קיימת על מנת להבטיח תוצאות מדויקות וניתנות לשחזור בטווח הארוך. זה כולל תחזוקה שוטפת של הציוד כדי להבטיח שהוא תמיד במצב עבודה תקין. כל החומרים המתכלים צריכים להיות באיכות גבוהה ועקבית בכל המנות המיוצרות, וזמינותם האמינה חייבת להיות מובטחת.
זמן פרסום: 29 בנובמבר 2022