Standarisasi proses mencakup pengoptimalan dan penetapan serta harmonisasi selanjutnya, yang memungkinkan kinerja optimal jangka panjang – terlepas dari pengguna. Standarisasi memastikan hasil berkualitas tinggi, serta reproduktifitas dan komparabilitasnya.
Tujuan PCR (klasik) adalah menghasilkan hasil yang andal dan dapat direproduksi. Untuk aplikasi tertentu, hasil PCRProduk PCRjuga relevan. Untuk reaksi ini, kehati-hatian harus dilakukan untuk memastikan bahwa sampel tidak terganggu dan alur kerja PCR tetap stabil. Secara khusus, ini berarti meminimalkan masuknya kontaminasi yang dapat menyebabkan hasil positif palsu atau negatif palsu atau bahkan menghambat reaksi PCR. Lebih jauh, kondisi reaksi harus seidentik mungkin untuk setiap sampel individu dalam satu proses dan juga dapat ditransfer ke reaksi berikutnya (dengan metode yang sama). Ini mengacu pada komposisi reaksi serta jenis kontrol suhu dalam siklus. Kesalahan pengguna, tentu saja, harus dihindari sebisa mungkin.
Di bawah ini, kami akan menunjukkan tantangan yang dihadapi selama persiapan dan selama berlangsungnya PCR – dan pendekatan terhadap solusi yang ada berkenaan dengan instrumen dan bahan habis pakai yang digunakan untuk standarisasi alur kerja PCR.
Persiapan reaksi
Penyaluran komponen reaksi ke dalam wadah PCR, atau pelat, masing-masing, mencakup beberapa tantangan yang harus diatasi:
Kondisi reaksi
Dosis yang tepat dan teliti dari masing-masing komponen sangat diperlukan saat menginginkan kondisi reaksi yang paling identik. Selain teknik pemipetan yang baik, pemilihan alat yang tepat juga penting. Campuran utama PCR sering kali mengandung zat yang meningkatkan viskositas atau menghasilkan busa. Selama proses pemipetan, zat ini menyebabkan pembasahan yang substansial padaujung pipet, sehingga mengurangi akurasi pemipetan. Penggunaan sistem pengeluaran langsung atau ujung pipet alternatif yang tidak mudah basah dapat meningkatkan akurasi dan presisi proses pemipetan.
Kontaminasi
Selama proses penyaluran, aerosol dihasilkan yang, jika dibiarkan mencapai bagian dalam pipet, berpotensi mencemari sampel lain selama langkah pemipetan berikutnya. Hal ini dapat dicegah dengan menggunakan ujung filter atau sistem pemindahan langsung.
Bahan habis pakai sepertikiat, wadah dan pelat yang digunakan dalam alur kerja PCR tidak boleh mengandung zat yang membahayakan sampel atau memalsukan hasil. Zat-zat ini meliputi DNA, DNase, RNase, dan inhibitor PCR, serta komponen yang berpotensi larut dari material selama reaksi – zat yang dikenal sebagai zat yang dapat larut.
Kesalahan pengguna
Semakin banyak sampel yang diproses, semakin tinggi risiko kesalahan. Sangat mudah terjadi bahwa sampel dipipet ke dalam bejana atau sumur yang salah. Risiko ini dapat dikurangi secara signifikan dengan penandaan sumur yang mudah dikenali. Melalui otomatisasi langkah-langkah pengeluaran, "faktor manusia", yaitu kesalahan dan variasi yang berkaitan dengan pengguna, diminimalkan, sehingga meningkatkan reproduktifitas, terutama dalam kasus volume reaksi kecil. Ini memerlukan pelat dengan stabilitas dimensi yang cukup untuk digunakan di stasiun kerja. Kode batang yang disertakan memberikan keterbacaan mesin tambahan, yang menyederhanakan pelacakan sampel di seluruh proses.
Pemrograman Thermocycler
Pemrograman instrumen dapat terbukti memakan waktu dan rawan kesalahan. Berbagai fitur PCR thermal cycler bekerja sama untuk menyederhanakan langkah proses ini dan, yang terpenting, membuatnya aman:
Pengoperasian yang mudah dan panduan pengguna yang baik merupakan dasar pemrograman yang efisien. Berdasarkan fondasi ini, administrasi pengguna yang dilindungi kata sandi akan mencegah program milik pengguna diubah oleh pengguna lain. Jika beberapa siklus (dengan tipe yang sama) digunakan, akan bermanfaat jika suatu program dapat ditransfer langsung dari satu instrumen ke instrumen lain melalui USB atau konektivitas. Perangkat lunak komputer memungkinkan administrasi program, hak pengguna, dan dokumen secara terpusat dan aman di komputer.
Tes PCR
Selama proses berlangsung, DNA diamplifikasi dalam wadah reaksi, di mana setiap sampel harus mengalami kondisi reaksi yang identik dan konsisten. Aspek-aspek berikut relevan untuk proses tersebut:
Kontrol suhu
Akurasi yang sangat baik dalam pengendalian suhu dan homogenitas blok siklus merupakan dasar untuk pengkondisian suhu yang merata pada semua sampel. Kualitas tinggi elemen pemanas dan pendingin (elemen peltier), serta cara elemen-elemen tersebut dihubungkan ke blok, merupakan faktor penentu yang akan menentukan risiko perbedaan suhu yang dikenal sebagai “efek tepi”
Penguapan
Konsentrasi masing-masing komponen reaksi tidak boleh berubah selama reaksi berlangsung karena penguapan. Jika tidak, sangat mungkin hanya sedikitProduk PCRdapat dihasilkan, atau tidak sama sekali. Oleh karena itu, sangat penting untuk meminimalkan penguapan dengan memastikan segel yang aman. Dalam hal ini, tutup termosikler yang dipanaskan dan segel bejana bekerja sama. Tersedia berbagai pilihan penyegelan untukPlat PCR (tautan: Artikel penyegelan), yang mana segel terbaik dicapai melalui penyegelan panas. Penutup lain juga dapat digunakan, asalkan tekanan kontak tutup siklus dapat disesuaikan dengan segel yang dipilih.
Standardisasi proses diterapkan untuk menjaga keakuratan dan hasil yang dapat direproduksi dalam jangka panjang. Ini termasuk pemeliharaan peralatan secara berkala untuk memastikan bahwa peralatan selalu dalam kondisi kerja yang baik. Semua bahan habis pakai harus memiliki kualitas tinggi secara konsisten di semua lot yang diproduksi, dan ketersediaannya yang andal harus dijamin.
Waktu posting: 29-Nov-2022