A folyamatok szabványosítása magában foglalja azok optimalizálását, majd azok létrehozását és harmonizálását, lehetővé téve a hosszú távú optimális teljesítményt – a felhasználótól függetlenül. A szabványosítás biztosítja a kiváló minőségű eredményeket, valamint azok reprodukálhatóságát és összehasonlíthatóságát.
A (klasszikus) PCR célja a megbízható és reprodukálható eredmény elérése. Bizonyos alkalmazásoknál a hozamPCR termékis releváns. Ezeknél a reakcióknál ügyelni kell arra, hogy a minták ne veszélyeztessenek, és hogy a PCR-munkafolyamat stabil maradjon. Ez konkrétan a szennyeződések bevezetésének minimalizálását jelenti, amelyek álpozitív vagy álnegatív eredményekhez vezethetnek, vagy akár gátolhatják a PCR-reakciót. Továbbá a reakciókörülményeknek a lehető legazonosabbaknak kell lenniük minden egyes mintánál egy futtatáson belül, és átvihetőknek kell lenniük a későbbi reakciókra (ugyanazzal a módszerrel). Ez vonatkozik a reakciók összetételére, valamint a cyclerben lévő hőmérséklet-szabályozás típusára. A felhasználói hibákat természetesen a lehető legnagyobb mértékben el kell kerülni.
Az alábbiakban bemutatjuk a PCR előkészítése és futtatása során felmerülő kihívásokat, valamint a PCR-munkafolyamatok szabványosításához használt eszközökkel és fogyóeszközökkel kapcsolatos megoldási megközelítéseket.
Reakció előkészítése
A reakciókomponensek PCR-tartályokba, illetve lemezekbe történő betöltése számos kihívást jelent, amelyeket le kell küzdeni:
Reakciófeltételek
Az egyes komponensek pontos és precíz adagolása elengedhetetlen a lehető legazonosabb reakciókörülmények eléréséhez. A jó pipettázási technika mellett a megfelelő eszköz kiválasztása is kritikus fontosságú. A PCR mastermixek gyakran tartalmaznak olyan anyagokat, amelyek növelik a viszkozitást vagy habzást okoznak. A pipettázási folyamat során ezek a felület jelentős nedvesedéséhez vezetnek.pipettahegyek, ezáltal csökkentve a pipettázási pontosságot. A közvetlen adagolórendszerek vagy a nedvesedésre kevésbé hajlamos alternatív pipettahegyek használata javíthatja a pipettázási folyamat pontosságát és precizitását.
Szennyeződések
Az adagolási folyamat során aeroszolok keletkeznek, amelyek, ha eljutnak a pipetta belsejébe, potenciálisan szennyezhetik a következő pipettázási lépés során a mintát. Ez szűrőhegyek vagy közvetlen kiszorításos rendszerek használatával megelőzhető.
Fogyóeszközök, mint példáultippekA PCR-munkafolyamatban használt edények és lemezek nem tartalmazhatnak olyan anyagokat, amelyek veszélyeztetik a mintát vagy meghamisítják az eredményt. Ilyenek például a DNS, a DNázok, az RNázok és a PCR-gátlók, valamint azok az összetevők, amelyek a reakció során potenciálisan kioldódhatnak az anyagból – ezeket az anyagokat kioldódó anyagoknak nevezzük.
Felhasználói hiba
Minél több mintát dolgoznak fel, annál nagyobb a hibalehetőség. Könnyen előfordulhat, hogy egy mintát rossz edénybe vagy rossz kútba pipettáznak. Ez a kockázat jelentősen csökkenthető a kútfejek könnyen észrevehető jelölésével. Az adagolási lépések automatizálásával minimalizálható az „emberi tényező”, azaz a hibák és a felhasználóval kapcsolatos eltérések, ezáltal növelve a reprodukálhatóságot, különösen kis reakciótérfogatok esetén. Ehhez megfelelő méretstabilitású lemezekre van szükség a munkaállomáson való alkalmazáshoz. A csatolt vonalkódok további gépi olvashatóságot biztosítanak, ami leegyszerűsíti a minta nyomon követését a teljes folyamat során.
A termocikler programozása
Egy műszer programozása időigényes és hibalehetőségekkel teli lehet. A PCR termosztatikus ciklusok különböző funkciói együttesen egyszerűsítik ezt a folyamatlépést, és ami a legfontosabb, biztonságossá teszik azt:
A hatékony programozás alapja az egyszerű kezelhetőség és a megfelelő felhasználói útmutatás. Erre az alapra építve a jelszóval védett felhasználó-adminisztráció megakadályozza, hogy más felhasználók módosítsák a saját programokat. Ha több (azonos típusú) cyclert használnak, előnyös, ha egy program közvetlenül átvihető az egyik műszerről a másikra USB-n vagy más csatlakozáson keresztül. A számítógépes szoftver lehetővé teszi a programok, felhasználói jogok és dokumentumok központi és biztonságos adminisztrációját a számítógépen.
PCR-futtatás
A futtatás során a DNS amplifikálása a reakcióedényben történik, ahol minden mintát azonos, konzisztens reakciókörülményeknek kell alávetni. A folyamat szempontjából a következő szempontok relevánsak:
Hőmérséklet-szabályozás
A hőmérséklet-szabályozás kiváló pontossága és a cycler blokk homogenitása az alapja az összes minta egyenletes hőmérséklet-kondicionálásának. A fűtő- és hűtőelemek (Peltier-elemek) kiváló minősége, valamint ezeknek a blokkhoz való csatlakoztatásának módja azok a döntő tényezők, amelyek meghatározzák a hőmérséklet-eltérések, az úgynevezett „élhatás” kockázatát.
Párolgás
Az egyes reakciókomponensek koncentrációjának a reakció során nem szabad változnia párolgás miatt. Ellenkező esetben lehetséges, hogy nagyon kevésPCR termékkeletkezhet, vagy egyáltalán nem. Ezért kulcsfontosságú a párolgás minimalizálása a biztonságos lezárás biztosításával. Ebben az esetben a termocikler fűtött teteje és az edény tömítése kéz a kézben működik. Különböző lezárási lehetőségek állnak rendelkezésrePCR lemezek (link: Lezárásról szóló cikk), ahol a legjobb tömítést hőzárással érik el. Más zárási módok is megfelelőek lehetnek, amennyiben a cycler fedelének érintkezési nyomása a kiválasztott tömítéshez igazítható.
A folyamatszabványosítás célja a pontos és reprodukálható eredmények hosszú távú biztosítása. Ez magában foglalja a berendezések rendszeres karbantartását annak biztosítása érdekében, hogy azok mindig jó működőképes állapotban legyenek. Minden fogyóeszköznek következetesen magas minőségűnek kell lennie az összes gyártott tételben, és megbízható elérhetőségüket garantálni kell.
Közzététel ideje: 2022. november 29.