Standardizacija procesa uključuje njihovu optimizaciju te naknadno uspostavljanje i usklađivanje, omogućujući dugoročne optimalne performanse – neovisno o korisniku. Standardizacija osigurava visokokvalitetne rezultate, kao i njihovu ponovljivost i usporedivost.
Cilj (klasične) PCR je generiranje pouzdanog i reproducibilnog rezultata. Za određene primjene, prinosPCR produkttakođer je relevantno. Za ove reakcije potrebno je paziti da uzorci nisu ugroženi i da PCR tijek rada ostane stabilan. To se konkretno prevodi u minimiziranje unošenja kontaminacija koje bi mogle dovesti do lažno pozitivnih ili lažno negativnih rezultata ili čak inhibirati PCR reakciju. Nadalje, uvjeti reakcije trebaju biti što identičniji za svaki pojedinačni uzorak unutar jednog ciklusa, a također i prenosivi na sljedeće reakcije (iste metode). To se odnosi na sastav reakcija kao i na vrstu kontrole temperature u cikleru. Naravno, pogreške korisnika treba izbjegavati koliko god je to moguće.
U nastavku ćemo prikazati izazove koji se javljaju tijekom pripreme i cijelog izvođenja PCR-a – te pristupe rješenjima koja postoje u odnosu na instrumente i potrošni materijal koji se koriste za standardizaciju PCR tijeka rada.
Priprema reakcije
Stavljanje reakcijskih komponenti u PCR posude, odnosno ploče, uključuje više izazova koje treba prevladati:
Reakcijski uvjeti
Točno i precizno doziranje pojedinačnih komponenti neophodno je kada se teže što identičnijim reakcijskim uvjetima. Uz dobru tehniku pipetiranja, ključan je i odabir pravog alata. PCR master-miksevi često sadrže tvari koje povećavaju viskoznost ili stvaraju pjenu. Tijekom procesa pipetiranja to dovodi do značajnog vlaženjavrhovi pipeta, čime se smanjuje točnost pipetiranja. Korištenje sustava za izravno doziranje ili alternativnih vrhova pipeta koji su manje skloni vlaženju može poboljšati točnost i preciznost procesa pipetiranja.
Kontaminacije
Tijekom procesa doziranja stvaraju se aerosoli koji, ako im se dopusti da dospiju u unutrašnjost pipete, mogu potencijalno kontaminirati drugi uzorak tijekom sljedećeg koraka pipetiranja. To se može spriječiti korištenjem filterskih vrhova ili sustava s izravnim istiskivanjem.
Potrošni materijal kao što susavjetiPosude i ploče koje se koriste u PCR postupku ne smiju sadržavati tvari koje ugrožavaju uzorak ili krivotvore rezultat. To uključuje DNA, DNaze, RNaze i inhibitore PCR-a, kao i komponente koje se potencijalno mogu isprazniti iz materijala tijekom reakcije – tvari poznate kao ispirajuće tvari.
Korisnička pogreška
Što se više uzoraka obrađuje, to je veći rizik od pogreške. Lako se može dogoditi da se uzorak pipetira u pogrešnu posudu ili pogrešnu jažicu. Taj se rizik može znatno smanjiti lako uočljivim označavanjem jažica. Automatizacijom koraka doziranja minimizira se „ljudski faktor“, tj. pogreške i varijacije povezane s korisnikom, čime se povećava ponovljivost, posebno u slučaju malih reakcijskih volumena. To zahtijeva ploče dovoljne dimenzijske stabilnosti koje se mogu koristiti u radnoj stanici. Priloženi barkodovi pružaju dodatnu strojnu čitljivost, što pojednostavljuje praćenje uzorka tijekom cijelog procesa.
Programiranje termociklera
Programiranje instrumenta može biti dugotrajno i sklono pogreškama. Različite značajke PCR termociklera rade zajedno kako bi pojednostavile ovaj korak procesa i, što je najvažnije, učinile ga sigurnim:
Jednostavno rukovanje i dobro korisničko vodstvo osnova su učinkovitog programiranja. Nadovezujući se na ovu osnovu, administracija korisnika zaštićena lozinkom spriječit će da drugi korisnici mijenjaju vlastite programe. Ako se koristi više ciklera (iste vrste), korisno je ako se program može izravno prenijeti s jednog instrumenta na drugi putem USB-a ili povezivosti. Računalni softver omogućuje centralizirano i sigurno upravljanje programima, korisničkim pravima i dokumentima na računalu.
PCR analiza
Tijekom postupka, DNA se amplificira u reakcijskoj posudi, gdje svaki uzorak treba biti podvrgnut identičnim, konzistentnim reakcijskim uvjetima. Sljedeći aspekti su relevantni za proces:
Kontrola temperature
Izvrsna točnost u kontroli temperature i homogenost bloka ciklera osnova su za ravnomjerno temperaturno kondicioniranje svih uzoraka. Visoka kvaliteta elemenata za grijanje i hlađenje (Peltierovi elementi), kao i način na koji su spojeni na blok, odlučujući su čimbenici koji će odrediti rizik od temperaturnih odstupanja poznatih kao "rubni efekt".
Isparavanje
Koncentracije pojedinačnih reakcijskih komponenti ne bi se smjele mijenjati tijekom reakcije zbog isparavanja. U suprotnom, moguće je da se vrlo maloPCR produktmože se generirati ili se uopće ne generira. Stoga je ključno smanjiti isparavanje osiguravanjem sigurnog brtvljenja. U ovom slučaju, grijani poklopac termociklera i brtva posude rade ruku pod ruku. Dostupne su različite opcije brtvljenja zaPCR ploče (link: Članak o zatvaranju), pri čemu se najbolje brtvljenje postiže toplinskim brtvljenjem. Mogu biti prikladni i drugi zatvarači, sve dok se kontaktni tlak poklopca ciklera može prilagoditi odabranom brtvljenju.
Standardizacija procesa je na snazi kako bi se dugoročno osigurali točni i ponovljivi rezultati. To uključuje redovito održavanje opreme kako bi se osiguralo da je uvijek u dobrom radnom stanju. Sav potrošni materijal treba biti dosljedno visoke kvalitete u svim proizvedenim serijama, a mora se jamčiti i njihova pouzdana dostupnost.
Vrijeme objave: 29. studenog 2022.