प्रक्रियाओं के मानकीकरण में उनका अनुकूलन और उसके बाद की स्थापना और सामंजस्य शामिल है, जिससे उपयोगकर्ता से स्वतंत्र दीर्घकालिक इष्टतम प्रदर्शन संभव हो सके। मानकीकरण उच्च-गुणवत्ता वाले परिणामों के साथ-साथ उनकी पुनरुत्पादकता और तुलनीयता सुनिश्चित करता है।
(क्लासिक) पीसीआर का लक्ष्य एक विश्वसनीय और पुनरुत्पादनीय परिणाम उत्पन्न करना है। कुछ अनुप्रयोगों के लिए, की उपजपीसीआर उत्पादभी प्रासंगिक है। इन प्रतिक्रियाओं के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि नमूनों से समझौता न किया जाए और पीसीआर वर्कफ़्लो स्थिर रहे। विशेष रूप से, इसका अर्थ है संदूषणों की शुरूआत को कम करना जो गलत सकारात्मक या गलत नकारात्मक परिणामों को जन्म दे सकता है या यहां तक कि पीसीआर प्रतिक्रिया को बाधित भी कर सकता है। इसके अलावा, प्रतिक्रिया की स्थिति एक रन के भीतर प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने के लिए यथासंभव समान होनी चाहिए और बाद की प्रतिक्रियाओं (एक ही विधि की) में भी स्थानांतरित की जा सकती है। यह प्रतिक्रियाओं की संरचना के साथ-साथ साइक्लर में तापमान नियंत्रण के प्रकार को संदर्भित करता है। बेशक, उपयोगकर्ता त्रुटियों को यथासंभव टाला जाना चाहिए।
नीचे, हम उन चुनौतियों का प्रदर्शन करेंगे जो पीसीआर की तैयारी और उसके संचालन के दौरान सामने आती हैं - और पीसीआर कार्यप्रवाह के मानकीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों के संबंध में मौजूद समाधानों के दृष्टिकोणों का भी प्रदर्शन करेंगे।
प्रतिक्रिया की तैयारी
प्रतिक्रिया घटकों को क्रमशः पीसीआर-पात्रों या प्लेटों में वितरित करने में कई चुनौतियाँ शामिल हैं, जिन्हें दूर करना आवश्यक है:
प्रतिक्रिया की स्थितियाँ
सबसे समान प्रतिक्रिया स्थितियों के लिए लक्ष्य बनाते समय व्यक्तिगत घटकों की सटीक और सटीक खुराक अपरिहार्य है। एक अच्छी पाइपिंग तकनीक के अलावा, सही उपकरण का चयन करना महत्वपूर्ण है। पीसीआर मास्टर-मिक्स में अक्सर ऐसे पदार्थ होते हैं जो चिपचिपाहट बढ़ाते हैं या झाग उत्पन्न करते हैं। पाइपिंग प्रक्रिया के दौरान, ये काफी गीलापन पैदा करते हैंपिपेट टिप्स, इस प्रकार पाइपिंग की सटीकता कम हो जाती है। प्रत्यक्ष डिस्पेंसिंग सिस्टम या वैकल्पिक पिपेट टिप्स का उपयोग जो गीलेपन के प्रति कम प्रवण होते हैं, पाइपिंग प्रक्रिया की सटीकता और परिशुद्धता में सुधार कर सकते हैं।
संदूषण
डिस्पेंसिंग प्रक्रिया के दौरान, एरोसोल उत्पन्न होते हैं, जिन्हें अगर पिपेट के अंदर तक पहुंचने दिया जाए, तो वे संभावित रूप से अगले पिपेटिंग चरण के दौरान दूसरे नमूने को दूषित कर सकते हैं। फ़िल्टर टिप्स या डायरेक्ट डिस्प्लेसमेंट सिस्टम का उपयोग करके इसे रोका जा सकता है।
उपभोग्य वस्तुएं जैसेसुझावोंपीसीआर वर्कफ़्लो में उपयोग किए जाने वाले बर्तन और प्लेट में ऐसे पदार्थ नहीं होने चाहिए जो नमूने को नुकसान पहुंचाते हों या परिणाम को गलत साबित करते हों। इनमें डीएनए, डीएनएस, आरएनएज़ और पीसीआर अवरोधक शामिल हैं, साथ ही ऐसे घटक भी शामिल हैं जो प्रतिक्रिया के दौरान सामग्री से संभावित रूप से निकल सकते हैं - ऐसे पदार्थ जिन्हें लीचेबल्स के रूप में जाना जाता है।
उपयोगकर्ता त्रुटि
जितने ज़्यादा सैंपल प्रोसेस किए जाते हैं, त्रुटि का जोखिम उतना ही ज़्यादा होता है। यह आसानी से हो सकता है कि कोई सैंपल गलत बर्तन या गलत वेल में पिपेट हो जाए। वेल के आसानी से पहचाने जा सकने वाले मार्किंग से इस जोखिम को काफ़ी हद तक कम किया जा सकता है। डिस्पेंसिंग चरणों के स्वचालन के ज़रिए, "मानव कारक", यानी, त्रुटियाँ और उपयोगकर्ता-संबंधी भिन्नताएँ कम से कम हो जाती हैं, जिससे पुनरुत्पादन क्षमता बढ़ जाती है, ख़ास तौर पर छोटे रिएक्शन वॉल्यूम के मामले में। इसके लिए वर्कस्टेशन में इस्तेमाल किए जाने वाले पर्याप्त आयामी स्थिरता वाले प्लेट की ज़रूरत होती है। संलग्न बारकोड अतिरिक्त मशीन-पठनीयता प्रदान करते हैं, जो पूरी प्रक्रिया के दौरान सैंपल ट्रैकिंग को सरल बनाता है।
थर्मोसाइक्लर की प्रोग्रामिंग
किसी उपकरण को प्रोग्राम करना समय लेने वाला और साथ ही त्रुटि-प्रवण साबित हो सकता है। विभिन्न पीसीआर थर्मल साइक्लर विशेषताएं इस प्रक्रिया चरण को सरल बनाने और सबसे महत्वपूर्ण रूप से इसे सुरक्षित बनाने के लिए एक साथ काम करती हैं:
आसान संचालन और अच्छा उपयोगकर्ता मार्गदर्शन कुशल प्रोग्रामिंग का आधार है। इस आधार पर निर्माण करते हुए, पासवर्ड-संरक्षित उपयोगकर्ता प्रशासन किसी के अपने कार्यक्रमों को अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा बदले जाने से रोकेगा। यदि कई साइक्लर (एक ही प्रकार के) उपयोग में हैं, तो यह फायदेमंद है यदि किसी प्रोग्राम को USB या कनेक्टिविटी के माध्यम से सीधे एक उपकरण से दूसरे में स्थानांतरित किया जा सकता है। कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर कंप्यूटर पर प्रोग्राम, उपयोगकर्ता अधिकारों और दस्तावेज़ों के केंद्रीय और सुरक्षित प्रशासन को सक्षम बनाता है।
पीसीआर रन
रन के दौरान, डीएनए को प्रतिक्रिया वाहिका में प्रवर्धित किया जाता है, जहाँ प्रत्येक नमूने को समान, सुसंगत प्रतिक्रिया स्थितियों के अधीन किया जाना चाहिए। प्रक्रिया के लिए निम्नलिखित पहलू प्रासंगिक हैं:
तापमान नियंत्रण
तापमान नियंत्रण में उत्कृष्ट सटीकता और साइक्लर ब्लॉक की समरूपता सभी नमूनों के तापमान को समान रूप से नियंत्रित करने का आधार है। हीटिंग और कूलिंग तत्वों (पेल्टीयर तत्वों) की उच्च गुणवत्ता, साथ ही जिस तरह से इन्हें ब्लॉक से जोड़ा जाता है, वे निर्णायक कारक हैं जो तापमान विसंगतियों के जोखिम को निर्धारित करेंगे जिन्हें "एज इफ़ेक्ट" के रूप में जाना जाता है।
वाष्पीकरण
वाष्पीकरण के कारण प्रतिक्रिया के दौरान अलग-अलग प्रतिक्रिया घटकों की सांद्रता में बदलाव नहीं होना चाहिए। अन्यथा, यह संभव है कि बहुत कमपीसीआर उत्पादउत्पन्न हो सकता है, या बिल्कुल भी नहीं। इसलिए एक सुरक्षित सील सुनिश्चित करके वाष्पीकरण को कम करना महत्वपूर्ण है। इस मामले में, थर्मोसाइक्लर का गर्म ढक्कन और बर्तन की सील एक साथ काम करते हैं। इसके लिए अलग-अलग सीलिंग विकल्प उपलब्ध हैंपीसीआर प्लेटें (लिंक: सीलिंग लेख), जिससे हीट सीलिंग के माध्यम से सबसे अच्छी सील प्राप्त की जाती है। अन्य क्लोजर भी उपयुक्त हो सकते हैं, जब तक कि साइक्लर ढक्कन के संपर्क दबाव को चयनित सील में समायोजित किया जा सकता है।
दीर्घ अवधि में सटीक और पुनरुत्पादनीय परिणामों की सुरक्षा के लिए प्रक्रिया मानकीकरण लागू है। इसमें उपकरणों का नियमित रखरखाव शामिल है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे हमेशा अच्छी कार्यशील स्थिति में रहें। उत्पादित सभी लॉट में सभी उपभोग्य वस्तुएं लगातार उच्च गुणवत्ता की होनी चाहिए, और उनकी विश्वसनीय उपलब्धता की गारंटी होनी चाहिए।
पोस्ट करने का समय: नवम्बर-29-2022