Prosessien standardointiin kuuluu niiden optimointi ja sitä seuraava käyttöönotto ja yhdenmukaistaminen, mikä mahdollistaa pitkän aikavälin optimaalisen suorituskyvyn – käyttäjästä riippumatta. Standardointi varmistaa korkealaatuiset tulokset sekä niiden toistettavuuden ja vertailukelpoisuuden.
(Klassisen) PCR:n tavoitteena on luotettavan ja toistettavan tuloksen tuottaminen. Tietyissä sovelluksissa saantoPCR-tuoteon myös tärkeää. Näissä reaktioissa on varmistettava, etteivät näytteet vaarannu ja että PCR-työnkulku pysyy vakaana. Tarkemmin sanottuna tämä tarkoittaa kontaminaatioiden minimoimista, jotka voivat johtaa vääriin positiivisiin tai vääriin negatiivisiin tuloksiin tai jopa estää PCR-reaktion. Lisäksi reaktio-olosuhteiden tulisi olla mahdollisimman identtiset jokaiselle yksittäiselle näytteelle saman ajon aikana ja ne tulisi voida siirtää myös seuraaviin reaktioihin (samalla menetelmällä). Tämä viittaa reaktioiden koostumukseen sekä syklerin lämpötilan säätötyyppiin. Käyttäjävirheitä on tietenkin vältettävä mahdollisimman paljon.
Seuraavaksi esittelemme PCR-testin valmistelun ja suorittamisen aikana kohdatut haasteet sekä ratkaisumallit, joita on olemassa PCR-työnkulkujen standardoinnissa käytettävien instrumenttien ja tarvikkeiden suhteen.
Reaktion valmistelu
Reaktiokomponenttien annostelu PCR-astioihin tai -levyihin sisältää useita haasteita, jotka on voitettava:
Reaktio-olosuhteet
Yksittäisten komponenttien tarkka ja täsmällinen annostelu on välttämätöntä, kun pyritään mahdollisimman identtisiin reaktio-olosuhteisiin. Hyvän pipetointitekniikan lisäksi oikean työkalun valinta on ratkaisevan tärkeää. PCR-pääseokset sisältävät usein aineita, jotka lisäävät viskositeettia tai muodostavat vaahtoa. Pipetoinnin aikana nämä johtavat seoksen huomattavaan kostumiseen.pipetinkärjet, mikä heikentää pipetoinnin tarkkuutta. Suorien annostelujärjestelmien tai vaihtoehtoisten, vähemmän kostumisalttiiden pipettikärkien käyttö voi parantaa pipetointiprosessin tarkkuutta ja täsmällisyyttä.
Kontaminaatiot
Annosteluprosessin aikana syntyy aerosoleja, jotka pipetin sisään joutuessaan voivat mahdollisesti saastuttaa seuraavan näytteen seuraavassa pipetointivaiheessa. Tämä voidaan estää käyttämällä suodatinkärkiä tai suorasyöttöjärjestelmiä.
Kulutustarvikkeet, kutenvinkkejäPCR-työnkulussa käytettävät astiat, astiat ja levyt eivät saa sisältää aineita, jotka vaarantavat näytteen tai vääristävät tulosta. Näitä ovat DNA, DNaasit, RNaasit ja PCR-estäjät sekä komponentit, jotka voivat mahdollisesti liueta materiaalista reaktion aikana – aineet, jotka tunnetaan liukenevina aineina.
Käyttäjävirhe
Mitä enemmän näytteitä käsitellään, sitä suurempi on virheriski. Näyte voi helposti pipetoida väärään astiaan tai väärään kuoppaan. Tätä riskiä voidaan vähentää huomattavasti kuoppien helposti havaittavalla merkinnällä. Annosteluvaiheiden automatisoinnin avulla minimoidaan "inhimillinen tekijä", eli virheet ja käyttäjään liittyvät vaihtelut, mikä lisää toistettavuutta, erityisesti pienten reaktiotilavuuksien tapauksessa. Tämä edellyttää, että työasemalla käytetään riittävän mittapysyviä levyjä. Kiinnitetyt viivakoodit tarjoavat lisää koneellista luettavuutta, mikä yksinkertaistaa näytteen seurantaa koko prosessin ajan.
Lämpösyklerin ohjelmointi
Laitteen ohjelmointi voi osoittautua aikaa vieväksi ja virhealttiiksi. PCR-lämpösyklerin eri ominaisuudet toimivat yhdessä yksinkertaistaakseen tätä prosessivaihetta ja ennen kaikkea tehdäkseen siitä turvallisen:
Helppokäyttöisyys ja hyvä käyttäjän opastus ovat tehokkaan ohjelmoinnin perusta. Tämän pohjalta salasanasuojattu käyttäjähallinta estää muita käyttäjiä muuttamasta omia ohjelmia. Jos käytössä on useita (saman tyyppisiä) syklereitä, on hyödyllistä, jos ohjelma voidaan siirtää suoraan laitteesta toiseen USB:n tai muun liitännän kautta. Tietokoneohjelmisto mahdollistaa ohjelmien, käyttäjäoikeuksien ja dokumenttien keskitetyn ja turvallisen hallinnan tietokoneella.
PCR-ajo
Ajon aikana DNA:ta monistetaan reaktioastiassa, jossa jokaisen näytteen tulee olla identtisissä, yhdenmukaisissa reaktio-olosuhteissa. Seuraavat näkökohdat ovat prosessin kannalta olennaisia:
Lämpötilan säätö
Erinomainen lämpötilansäädön tarkkuus ja syklerilohkon homogeenisuus ovat perusta kaikkien näytteiden tasaiselle lämpötilakäsittelylle. Lämmitys- ja jäähdytyselementtien (Peltier-elementtien) korkea laatu sekä tapa, jolla ne on kytketty lohkoon, ovat ratkaisevia tekijöitä, jotka määräävät lämpötilaerojen riskin, joka tunnetaan nimellä "reunavaikutus".
Haihtuminen
Yksittäisten reaktiokomponenttien pitoisuuksien ei pitäisi muuttua reaktion aikana haihtumisen vuoksi. Muuten on mahdollista, että hyvin vähänPCR-tuotevoi syntyä tai ei ollenkaan. Siksi on ratkaisevan tärkeää minimoida haihtuminen varmistamalla tiivis tiiviste. Tässä tapauksessa termosyklerin lämmitetty kansi ja astian tiiviste toimivat käsi kädessä. Saatavilla on erilaisia sulkemisvaihtoehtojaPCR-levyt (linkki: Artikkeli sulkemisesta), jolloin paras tiivistys saavutetaan kuumasaumaamalla. Myös muut sulkimet voivat sopia, kunhan syklerin kannen kosketuspainetta voidaan säätää valitun tiivisteen mukaan.
Prosessien standardointi on käytössä tarkkojen ja toistettavien tulosten turvaamiseksi pitkällä aikavälillä. Tähän sisältyy laitteiden säännöllinen huolto sen varmistamiseksi, että ne ovat aina hyvässä toimintakunnossa. Kaikkien kulutustarvikkeiden on oltava tasaisen korkealaatuisia kaikissa tuotetuissa erissä, ja niiden luotettava saatavuus on taattava.
Julkaisun aika: 29.11.2022