Standardizace procesů zahrnuje jejich optimalizaci a následné stanovení a harmonizaci, což umožňuje dlouhodobý optimální výkon – nezávisle na uživateli. Standardizace zajišťuje vysoce kvalitní výsledky, stejně jako jejich reprodukovatelnost a srovnatelnost.
Cílem (klasické) PCR je dosažení spolehlivého a reprodukovatelného výsledku. Pro určité aplikace je výtěžekPCR produktje také relevantní. U těchto reakcí je třeba dbát na to, aby vzorky nebyly ohroženy a aby pracovní postup PCR zůstal stabilní. Konkrétně se to projevuje v minimalizaci zavlečení kontaminací, které by mohly vést k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům, nebo dokonce inhibovat reakci PCR. Reakční podmínky by dále měly být pro každý jednotlivý vzorek v rámci běhu co nejshodnější a měly by být přenositelné i na následné reakce (stejné metody). To se týká složení reakcí i typu regulace teploty v cykleru. Chyby uživatele je samozřejmě třeba co nejvíce vyhnout.
Níže ukážeme problémy, s nimiž se setkáváme během přípravy a v průběhu PCR – a přístupy k řešením, které existují s ohledem na přístroje a spotřební materiál používaný pro standardizaci pracovních postupů PCR.
Příprava reakce
Dávkování reakčních složek do PCR nádob, respektive destiček, s sebou nese řadu problémů, které je třeba překonat:
Reakční podmínky
Přesné a precizní dávkování jednotlivých složek je nezbytné pro dosažení co nejshodnějších reakčních podmínek. Kromě správné pipetovací techniky je zásadní i výběr správného nástroje. PCR mastermixy často obsahují látky, které zvyšují viskozitu nebo vytvářejí pěnu. Během pipetovacího procesu to vede k značnému smáčení směsi.špičky pipet, čímž se snižuje přesnost pipetování. Použití systémů pro přímé dávkování nebo alternativních pipetovacích špiček, které jsou méně náchylné k smáčení, může zlepšit přesnost a preciznost pipetovacího procesu.
Kontaminace
Během procesu dávkování vznikají aerosoly, které, pokud se dostanou do vnitřku pipety, mohou potenciálně kontaminovat další vzorek během dalšího kroku pipetování. Tomu lze zabránit použitím filtračních špiček nebo systémů s přímým výtlačným tlakem.
Spotřební materiál, jako např.tipyNádoby a destičky používané v PCR postupu nesmí obsahovat látky, které by mohly ohrozit kvalitu vzorku nebo zkreslit výsledek. Patří mezi ně DNA, DNázy, RNázy a inhibitory PCR, a také složky, které by se mohly během reakce z materiálu vyluhovat – látky známé jako vyluhovatelné látky.
Chyba uživatele
Čím více vzorků je zpracováno, tím vyšší je riziko chyby. Může se snadno stát, že vzorek je pipetován do nesprávné nádobky nebo nesprávné jamky. Toto riziko lze výrazně snížit snadno rozpoznatelným označením jamek. Automatizací dávkovacích kroků se minimalizuje „lidský faktor“, tj. chyby a odchylky související s uživatelem, čímž se zvyšuje reprodukovatelnost, zejména v případě malých reakčních objemů. To vyžaduje použití destiček s dostatečnou rozměrovou stabilitou v pracovní stanici. Připojené čárové kódy poskytují dodatečnou strojovou čitelnost, což zjednodušuje sledování vzorku v celém procesu.
Programování termocykleru
Programování přístroje může být časově náročné a náchylné k chybám. Různé funkce PCR termocykleru spolupracují na zjednodušení tohoto procesního kroku a především na jeho bezpečnosti:
Snadná obsluha a dobré uživatelské vedení jsou základem efektivního programování. Na tomto základě zabrání správa uživatelů chráněná heslem tomu, aby ostatní uživatelé změnili vlastní programy. Pokud se používá více cyklerů (stejného typu), je výhodné, pokud lze program přenést přímo z jednoho přístroje do druhého přes USB nebo jiné připojení. Počítačový software umožňuje centrální a bezpečnou správu programů, uživatelských práv a dokumentů v počítači.
PCR běh
Během analýzy je DNA amplifikována v reakční nádobě, kde by měl být každý vzorek vystaven identickým, konzistentním reakčním podmínkám. Pro tento proces jsou relevantní následující aspekty:
Regulace teploty
Vynikající přesnost regulace teploty a homogenita bloku cykleru jsou základem pro rovnoměrné temperování všech vzorků. Vysoká kvalita topných a chladicích prvků (Peltierovy články) a způsob jejich připojení k bloku jsou rozhodujícími faktory, které určují riziko teplotních odchylek známých jako „okrajový efekt“.
Vypařování
Koncentrace jednotlivých reakčních složek by se v průběhu reakce neměly měnit v důsledku odpařování. Jinak je možné, že se vyloučí jen velmi máloPCR produktmůže se vytvářet, nebo vůbec žádný. Proto je zásadní minimalizovat odpařování zajištěním bezpečného utěsnění. V tomto případě spolupracuje vyhřívané víko termocykleru a těsnění nádoby ruku v ruce. K dispozici jsou různé možnosti utěsnění proPCR destičky (odkaz: Článek o uzavírání), přičemž nejlepšího utěsnění se dosáhne tepelným svařením. Vhodné mohou být i jiné uzávěry, pokud lze kontaktní tlak víka cykleru přizpůsobit zvolenému těsnění.
Standardizace procesů je zavedena za účelem zajištění přesných a reprodukovatelných výsledků v dlouhodobém horizontu. To zahrnuje pravidelnou údržbu zařízení, aby bylo zajištěno, že je vždy v dobrém provozním stavu. Veškerý spotřební materiál by měl mít trvale vysokou kvalitu napříč všemi vyrobenými šaržemi a musí být zaručena jeho spolehlivá dostupnost.
Čas zveřejnění: 29. listopadu 2022