A standardizazione di i prucessi include a so ottimizazione è a successiva creazione è armunizazione, chì permette una prestazione ottima à longu andà - indipendentemente da l'utente. A standardizazione assicura risultati di alta qualità, è ancu a so riproducibilità è paragunabilità.
L'obiettivu di a PCR (classica) hè a generazione di un risultatu affidabile è riproducibile. Per certe applicazioni, u rendimentu di uPruduttu PCRhè ancu pertinente. Per queste reazioni, ci vole à fà attenzione à assicurà chì i campioni ùn sianu micca cumprumessi è chì u flussu di travagliu PCR resti stabile. In particulare, questu si traduce in minimizà l'introduzione di contaminazioni chì puderanu purtà à risultati falsi pusitivi o falsi negativi o ancu inibisce a reazione PCR. Inoltre, e cundizioni di reazione devenu esse u più identiche pussibule per ogni campione individuale in una corsa è ancu esse trasferibili à reazioni successive (di u listessu metudu). Questu si riferisce à a cumpusizione di e reazioni è ancu à u tipu di cuntrollu di a temperatura in u ciclatore. L'errori di l'utente, benintesa, devenu esse evitati u più pussibule.
Quì sottu, dimustraremu e sfide chì si scontranu durante a preparazione è in tuttu u corsu di una PCR - è l'approcci à e suluzioni chì esistenu in quantu à i strumenti è i consumabili utilizati per a standardizazione di i flussi di travagliu PCR.
Preparazione di a reazione
A distribuzione di cumpunenti di reazione in recipienti PCR, o piastre, rispettivamente, comprende parechje sfide chì devenu esse superate:
Cundizioni di reazione
U dosaggio esattu è precisu di i cumpunenti individuali hè indispensabile quandu si cercanu e cundizioni di reazione più identiche pussibule. In più di una bona tecnica di pipettaggio, a scelta di u strumentu ghjustu hè cruciale. I master-mixes PCR cuntenenu spessu sustanzi chì aumentanu a viscosità o generanu schiuma. Durante u prucessu di pipettaggio, questi portanu à una bagnatura sustanziale di upunte di pipetta, riducendu cusì a precisione di u pipettaggio. L'usu di sistemi di dispensazione diretta o punte di pipetta alternative chì sò menu propensi à bagnà pò migliurà a precisione è l'accuratezza di u prucessu di pipettaggio.
Cuntaminazioni
Durante u prucessu di dispensazione, si generanu aerosoli chì, s'elli sò lasciati ghjunghje à l'internu di a pipetta, ponu potenzialmente contaminà un altru campione durante a prossima tappa di pipettaggio. Questu pò esse impeditu aduprendu punte di filtru o sistemi di spustamentu direttu.
Consumabili cum'ècunsigliiI recipienti è e piastre chì sò aduprati in u flussu di travagliu PCR ùn devenu micca cuntene sustanzi chì compromettenu u campione o falsificanu u risultatu. Quessi includenu DNA, DNasi, RNasi è inibitori di PCR, è ancu cumpunenti chì ponu potenzialmente liscivià da u materiale durante a reazione - sustanzi cunnisciuti cum'è liscivibili.
Errore di l'utilizatore
Più campioni sò trattati, più altu hè u risicu d'errore. Pò accade facilmente chì un campione sia pipettatu in u vasu sbagliatu o in u pozzu sbagliatu. Stu risicu pò esse riduttu cunsiderabilmente da una marcatura facilmente discernibile di i pozzi. Attraversu l'automatizazione di e tappe di dispensazione, u "fattore umanu", vale à dì, l'errori è e variazioni legate à l'utente, sò minimizzati, aumentendu cusì a riproducibilità, in particulare in u casu di picculi volumi di reazione. Questu richiede piastre di sufficiente stabilità dimensionale da esse impiegate in una stazione di travagliu. I codici à barre attaccati furniscenu una lettura automatica supplementaria, chì simplifica u tracciamentu di i campioni in tuttu u prucessu.
Prugrammazione di u termociclatore
A prugrammazione di un strumentu pò esse longa è ancu propensa à l'errori. Diverse caratteristiche di u termociclatore PCR travaglianu inseme per simplificà sta tappa di u prucessu è, soprattuttu, per rende lu sicuru:
Un funziunamentu faciule è una bona guida per l'utente sò a basa di una prugrammazione efficiente. Basendu si nantu à sta basa, l'amministrazione di l'utente prutetta da password impedirà chì i propri prugrammi sianu mudificati da altri utilizatori. Se parechji ciclatori (di u listessu tipu) sò in usu, hè beneficu se un prugramma pò esse trasferitu direttamente da un strumentu à l'altru via USB o cunnessione. U software di l'urdinatore permette l'amministrazione cintrale è sicura di i prugrammi, i diritti di l'utente è i documenti nantu à un urdinatore.
Esecuzione PCR
Durante a corsa, l'ADN hè amplificatu in u vasu di reazione, induve ogni campione deve esse sottumessu à cundizioni di reazione identiche è coerenti. I seguenti aspetti sò pertinenti per u prucessu:
Cuntrollu di a temperatura
L'eccellente precisione in u cuntrollu di a temperatura è l'omogeneità di u bloccu di ciclazione sò a basa per un cundiziunamentu uniforme di a temperatura di tutti i campioni. L'alta qualità di l'elementi di riscaldamentu è di raffreddamentu (elementi Peltier), è ancu u modu in cui questi sò cunnessi à u bloccu, sò i fattori decisivi chì determineranu u risicu di discrepanze di temperatura cunnisciute cum'è "effettu di punta".
Evaporazione
E cuncentrazioni di i cumpunenti individuali di a reazione ùn devenu micca cambià durante a reazione per via di l'evaporazione. Altrimenti, hè pussibule chì assai pocuPruduttu PCRpò esse generatu, o micca. Hè dunque cruciale di minimizà l'evaporazione assicurendu una sigillatura sicura. In questu casu, u coperchio riscaldatu di u termociclatore è a sigillatura di u vasu travaglianu inseme. Diverse opzioni di sigillatura sò dispunibili perPiastre PCR (ligame: Articulu di sigillatura), per mezu di a quale a megliu sigillatura hè ottenuta per mezu di a sigillatura à calore. Altre chiusure ponu ancu esse adatte, basta chì a pressione di cuntattu di u coperchio di u ciclatore possi esse adattata à a sigillatura scelta.
A standardizazione di u prucessu hè in piazza per salvaguardà risultati precisi è riproducibili à longu andà. Questu include a manutenzione regulare di l'attrezzatura per assicurà chì sia sempre in bonu statu di funziunamentu. Tutti i cunsumabili devenu esse di qualità costantemente alta in tutti i lotti prudutti, è a so dispunibilità affidabile deve esse garantita.
Data di publicazione: 29 di nuvembre di u 2022