Стандартизацията на процесите включва тяхната оптимизация и последващо установяване и хармонизиране, позволяващи дългосрочна оптимална производителност – независимо от потребителя. Стандартизацията осигурява висококачествени резултати, както и тяхната възпроизводимост и сравнимост.
Целта на (класическата) PCR е генерирането на надежден и възпроизводим резултат. За определени приложения, добивът наPCR продуктсъщо е от значение. За тези реакции трябва да се внимава, за да се гарантира, че пробите не са компрометирани и че PCR работният процес остава стабилен. По-конкретно, това се изразява в минимизиране на въвеждането на замърсявания, които биха могли да доведат до фалшиво положителни или фалшиво отрицателни резултати или дори да инхибират PCR реакцията. Освен това, реакционните условия трябва да бъдат възможно най-идентични за всяка отделна проба в рамките на един цикъл и също така да могат да се прехвърлят към последващи реакции (по същия метод). Това се отнася както до състава на реакциите, така и до вида на температурния контрол в сайклера. Грешките на потребителя, разбира се, трябва да се избягват, доколкото е възможно.
По-долу ще демонстрираме предизвикателствата, които се срещат по време на подготовката и провеждането на PCR – и подходите към решенията, които съществуват по отношение на инструментите и консумативите, използвани за стандартизация на PCR работните процеси.
Подготовка на реакцията
Разпределянето на реакционните компоненти в PCR съдове или съответно плаки е свързано с множество предизвикателства, които трябва да бъдат преодолени:
Условия на реакцията
Точното и прецизно дозиране на отделните компоненти е задължително, когато се стремим към възможно най-идентични реакционни условия. В допълнение към добрата техника на пипетиране, изборът на правилния инструмент е от решаващо значение. PCR мастер-миксовете често съдържат вещества, които повишават вискозитета или образуват пяна. По време на процеса на пипетиране това води до значително омокряне на...накрайници за пипети, като по този начин намалява точността на пипетиране. Използването на системи за директно дозиране или алтернативни накрайници за пипети, които са по-малко склонни към намокряне, може да подобри точността и прецизността на процеса на пипетиране.
Замърсявания
По време на процеса на дозиране се генерират аерозоли, които, ако достигнат вътрешността на пипетата, могат потенциално да замърсят друга проба по време на следващата стъпка на пипетиране. Това може да се предотврати чрез използване на филтърни накрайници или системи за директно изместване.
Консумативи като напримерсъветиСъдовете и плаките, използвани в PCR процеса, не трябва да съдържат вещества, които компрометират пробата или фалшифицират резултата. Те включват ДНК, ДНК-ази, РНК-ази и PCR инхибитори, както и компоненти, които потенциално могат да се отделят от материала по време на реакцията – вещества, известни като отделяеми вещества.
Грешка на потребителя
Колкото повече проби се обработват, толкова по-висок е рискът от грешки. Лесно може да се случи проба да бъде пипетирана в грешен съд или в грешната ямка. Този риск може да бъде значително намален чрез лесно различимо маркиране на ямките. Чрез автоматизацията на стъпките на дозиране, „човешкият фактор“, т.е. грешки и вариации, свързани с потребителя, се свеждат до минимум, като по този начин се увеличава възпроизводимостта, особено в случай на малки реакционни обеми. Това изисква плаки с достатъчна размерна стабилност, които да се използват в работна станция. Прикрепените баркодове осигуряват допълнителна машинна четимост, което опростява проследяването на пробите през целия процес.
Програмиране на термоциклера
Програмирането на инструмент може да се окаже отнемащо време, както и податливо на грешки. Различните характеристики на PCR термоциклера работят заедно, за да опростят тази стъпка от процеса и, най-важното, да я направят безопасна:
Лесната работа и доброто ръководство за потребителя са в основата на ефективното програмиране. Надграждайки върху тази основа, защитеното с парола администриране на потребителите ще предотврати промяната на собствените програми от други потребители. Ако се използват множество сайклери (от един и същи тип), е полезно програмата да може да се прехвърля директно от един инструмент на друг чрез USB или свързаност. Компютърният софтуер позволява централизирано и сигурно администриране на програми, потребителски права и документи на компютър.
PCR цикъл
По време на процеса, ДНК се амплифицира в реакционния съд, където всяка проба трябва да бъде подложена на идентични, последователни реакционни условия. Следните аспекти са от значение за процеса:
Контрол на температурата
Отличната точност при контрол на температурата и хомогенността на цикличния блок са основата за равномерно температурно кондициониране на всички проби. Високото качество на нагревателните и охлаждащите елементи (елементи на Пелтие), както и начинът, по който те са свързани към блока, са решаващите фактори, които ще определят риска от температурни разлики, известни като „ефект на ръба“.
Изпаряване
Концентрациите на отделните реакционни компоненти не трябва да се променят по време на реакцията поради изпаряване. В противен случай е възможно много малкоPCR продуктможе да се генерира или изобщо да не се генерира. Следователно е изключително важно да се сведе до минимум изпарението, като се осигури сигурно уплътнение. В този случай нагрятият капак на термоциклера и уплътнението на съда работят ръка за ръка. Предлагат се различни опции за уплътняване заPCR плаки (линк: Запечатваща статия), при което най-доброто уплътнение се постига чрез термично запечатване. Други затварящи устройства също могат да бъдат подходящи, стига контактното налягане на капака на циклера да може да се регулира спрямо избраното уплътнение.
Стандартизацията на процесите е налице, за да се гарантират точни и възпроизводими резултати в дългосрочен план. Това включва редовна поддръжка на оборудването, за да се гарантира, че то винаги е в добро работно състояние. Всички консумативи трябва да са с постоянно високо качество във всички произведени партиди и тяхната надеждна наличност трябва да бъде гарантирана.
Време на публикуване: 29 ноември 2022 г.