Стандартизація процесів включає їх оптимізацію та подальше встановлення й гармонізацію, що дозволяє досягати довгострокової оптимальної продуктивності – незалежно від користувача. Стандартизація забезпечує високоякісні результати, а також їх відтворюваність та порівнянність.
Метою (класичної) ПЛР є отримання надійного та відтворюваного результату. Для певних застосувань вихідПЛР-продукттакож актуально. Для цих реакцій необхідно подбати про те, щоб зразки не були порушені, а робочий процес ПЛР залишався стабільним. Зокрема, це означає мінімізацію внесення забруднень, які можуть призвести до хибнопозитивних або хибнонегативних результатів або навіть пригнічувати реакцію ПЛР. Крім того, умови реакції повинні бути максимально ідентичними для кожного окремого зразка в рамках циклу, а також переноситися на наступні реакції (того ж методу). Це стосується складу реакцій, а також типу контролю температури в циклері. Звичайно, помилок користувача слід уникати наскільки це можливо.
Нижче ми продемонструємо проблеми, з якими стикаються під час підготовки та проведення ПЛР, а також підходи до рішень, що існують стосовно інструментів та витратних матеріалів, що використовуються для стандартизації робочих процесів ПЛР.
Підготовка реакції
Розподіл реакційних компонентів у ПЛР-судини або планшети відповідно пов'язаний з численними труднощами, які необхідно подолати:
Умови реакції
Точне та прецизійне дозування окремих компонентів є незамінним для досягнення максимально ідентичних умов реакції. Окрім належної техніки піпетування, вирішальним є вибір правильного інструменту. ПЛР-мастер-суміші часто містять речовини, які підвищують в'язкість або утворюють піну. Під час процесу піпетування це призводить до значного зволоження суміші.наконечники піпеток, що знижує точність піпетування. Використання систем прямого дозування або альтернативних наконечників піпеток, які менш схильні до змочування, може підвищити точність і прецизійність процесу піпетування.
Забруднення
Під час процесу дозування утворюються аерозолі, які, якщо їм дозволити потрапити всередину піпетки, можуть потенційно забруднити інший зразок під час наступного етапу піпетування. Цьому можна запобігти, використовуючи фільтруючі наконечники або системи прямого витіснення.
Витратні матеріали, такі якпорадиПосудини та планшети, що використовуються в робочому процесі ПЛР, не повинні містити речовин, які можуть поставити під загрозу якість зразка або спотворити результат. До них належать ДНК, ДНКази, РНКази та інгібітори ПЛР, а також компоненти, які потенційно можуть вилуговуватися з матеріалу під час реакції – речовини, відомі як вилуговувані речовини.
Помилка користувача
Чим більше зразків обробляється, тим вищий ризик помилки. Легко може статися, що зразок піпетують не в ту посудину або не в ту лунку. Цей ризик можна значно зменшити завдяки легко помітному маркуванню лунок. Завдяки автоматизації етапів дозування мінімізується «людський фактор», тобто помилки та варіації, пов’язані з користувачем, що підвищує відтворюваність, особливо у випадку малих об’ємів реакції. Це вимагає використання на робочій станції планшетів з достатньою розмірною стабільністю. Прикріплені штрих-коди забезпечують додаткову машинну зчитуваність, що спрощує відстеження зразків протягом усього процесу.
Програмування термоциклера
Програмування приладу може зайняти багато часу та призвести до помилок. Різні функції термоциклера для ПЛР працюють разом, щоб спростити цей етап процесу та, що найважливіше, зробити його безпечним:
Просте керування та гарне керівництво користувача є основою ефективного програмування. Спираючись на цю основу, адміністрування користувачів із захистом паролем запобігатиме зміні власних програм іншими користувачами. Якщо використовується кілька циклерів (однакового типу), корисно, щоб програму можна було перенести безпосередньо з одного приладу на інший через USB або з'єднання. Комп'ютерне програмне забезпечення дозволяє централізовано та безпечно адмініструвати програми, права користувачів та документи на комп'ютері.
ПЛР-прогін
Під час аналізу ДНК ампліфікується в реакційній посудині, де кожен зразок має піддаватися однаковим, послідовним умовам реакції. Для процесу важливі такі аспекти:
Контроль температури
Відмінна точність контролю температури та однорідність блоку циклера є основою для рівномірного температурного кондиціонування всіх зразків. Висока якість нагрівальних та охолоджувальних елементів (елементів Пельтьє), а також спосіб їх підключення до блоку є вирішальними факторами, що визначатимуть ризик температурних розбіжностей, відомих як «крайовий ефект».
Випаровування
Концентрації окремих компонентів реакції не повинні змінюватися протягом реакції через випаровування. В іншому випадку можливо, що дуже малоПЛР-продуктможе утворюватися, або взагалі не утворюватися. Тому вкрай важливо мінімізувати випаровування, забезпечивши надійне ущільнення. У цьому випадку нагріта кришка термоциклера та ущільнення посудини працюють пліч-о-пліч. Доступні різні варіанти ущільнення дляПЛР-планшети (посилання: стаття про герметизацію), завдяки чому найкраще ущільнення досягається за допомогою термічного зварювання. Інші закриваючі елементи також можуть бути придатними, за умови, що контактний тиск кришки циклера можна налаштувати відповідно до вибраного ущільнення.
Стандартизація процесу запроваджується для забезпечення точних та відтворюваних результатів у довгостроковій перспективі. Це включає регулярне технічне обслуговування обладнання, щоб забезпечити його постійний робочий стан. Усі витратні матеріали повинні бути постійно високої якості для всіх вироблених партій, а їх надійна доступність має бути гарантована.
Час публікації: 29 листопада 2022 р.