Proseslerin standardizasyonu, optimizasyonlarını ve ardından kurulum ve uyumlaştırmayı içerir ve kullanıcıdan bağımsız olarak uzun vadeli optimum performansa izin verir. Standardizasyon, yüksek kaliteli sonuçların yanı sıra bunların tekrarlanabilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini de garanti eder.
(Klasik) PCR'nin amacı güvenilir ve tekrarlanabilir bir sonuç üretmektir. Belirli uygulamalar için, verimPCR ürünüAyrıca önemlidir. Bu reaksiyonlar için, numunelerin tehlikeye atılmaması ve PCR iş akışının stabil kalması için özen gösterilmelidir. Özellikle, bu, yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlara yol açabilecek veya hatta PCR reaksiyonunu engelleyebilecek kontaminasyonların girişini en aza indirmek anlamına gelir. Ayrıca, reaksiyon koşulları bir çalışma içindeki her bir numune için mümkün olduğunca aynı olmalı ve ayrıca sonraki reaksiyonlara (aynı yöntemle) aktarılabilir olmalıdır. Bu, reaksiyonların bileşiminin yanı sıra döngüleyicideki sıcaklık kontrol türünü de ifade eder. Elbette, kullanıcı hatalarından mümkün olduğunca kaçınılmalıdır.
Aşağıda, PCR hazırlığı ve çalışması sırasında karşılaşılan zorlukları ve PCR iş akışlarının standardizasyonu için kullanılan araç ve sarf malzemeleri açısından mevcut çözüm yaklaşımlarını göstereceğiz.
Reaksiyon hazırlığı
Reaksiyon bileşenlerinin PCR kaplarına veya plakalara dağıtımı, üstesinden gelinmesi gereken çok sayıda zorluğu içermektedir:
Tepkime koşulları
Mümkün olan en özdeş reaksiyon koşullarını hedeflerken, bireysel bileşenlerin tam ve kesin dozajlanması vazgeçilmezdir. İyi bir pipetleme tekniğine ek olarak, doğru aracı seçmek kritik öneme sahiptir. PCR ana karışımları sıklıkla viskoziteyi artıran veya köpük oluşturan maddeler içerir. Pipetleme işlemi sırasında, bunlarpipet uçları, böylece pipetleme doğruluğu azalır. Islanmaya daha az eğilimli doğrudan dağıtım sistemlerinin veya alternatif pipet uçlarının kullanımı pipetleme işleminin doğruluğunu ve hassasiyetini artırabilir.
Kirlenmeler
Dağıtım işlemi sırasında, pipetin içine ulaşmasına izin verilirse bir sonraki pipetleme adımında başka bir örneği kirletebilecek aerosoller üretilir. Bu, filtre uçları veya doğrudan yer değiştirme sistemleri kullanılarak önlenebilir.
Sarf malzemeleri gibiipuçlarıPCR iş akışında kullanılan kaplar ve plakalar, numuneyi tehlikeye atan veya sonucu tahrif eden maddeler içermemelidir. Bunlara DNA, DNazlar, RNazlar ve PCR inhibitörlerinin yanı sıra reaksiyon sırasında malzemeden sızma potansiyeli olan bileşenler de dahildir - sızabilir maddeler olarak bilinen maddeler.
Kullanıcı hatası
Ne kadar çok numune işlenirse, hata riski o kadar yüksek olur. Bir numunenin yanlış kaba veya yanlış kuyuya pipetlenmesi kolayca gerçekleşebilir. Bu risk, kuyuların kolayca fark edilebilir şekilde işaretlenmesiyle önemli ölçüde azaltılabilir. Dağıtım adımlarının otomasyonu sayesinde, "insan faktörü", yani hatalar ve kullanıcıyla ilgili değişiklikler en aza indirilir ve böylece özellikle küçük reaksiyon hacimleri durumunda tekrarlanabilirlik artar. Bu, bir iş istasyonunda yeterli boyutsal kararlılığa sahip plakaların kullanılmasını gerektirir. Ekli barkodlar, tüm süreç boyunca numune takibini basitleştiren ek makine okunabilirliği sağlar.
Termosikler programlama
Bir aleti programlamak zaman alıcı ve hataya açık olabilir. Farklı PCR termal döngüleyici özellikleri bu işlem adımını basitleştirmek ve en önemlisi güvenli hale getirmek için birlikte çalışır:
Kolay kullanım ve iyi kullanıcı rehberliği, verimli programlamanın temelidir. Bu temele dayanarak, parola korumalı kullanıcı yönetimi, kişinin kendi programlarının diğer kullanıcılar tarafından değiştirilmesini önleyecektir. Birden fazla döngü cihazı (aynı tipte) kullanılıyorsa, bir programın USB veya bağlantı yoluyla doğrudan bir cihazdan diğerine aktarılabilmesi faydalıdır. Bilgisayar yazılımı, bir bilgisayardaki programların, kullanıcı haklarının ve belgelerin merkezi ve güvenli bir şekilde yönetilmesini sağlar.
PCR çalışması
Çalışma sırasında, her numunenin aynı, tutarlı reaksiyon koşullarına tabi tutulması gereken reaksiyon kabında DNA çoğaltılır. Aşağıdaki hususlar süreç için önemlidir:
Sıcaklık kontrolü
Sıcaklık kontrolündeki mükemmel doğruluk ve döngü bloğunun homojenliği, tüm numunelerin eşit sıcaklık koşullandırmasının temelini oluşturur. Isıtma ve soğutma elemanlarının (peltier elemanları) yüksek kalitesi ve bunların bloğa bağlanma şekli, "kenar etkisi" olarak bilinen sıcaklık farklılıkları riskini belirleyecek belirleyici faktörlerdir.
Buharlaşma
Bireysel reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonları buharlaşma nedeniyle reaksiyon süresince değişmemelidir. Aksi takdirde, çok azPCR ürünüüretilebilir veya hiç üretilmeyebilir. Bu nedenle, güvenli bir sızdırmazlık sağlayarak buharlaşmayı en aza indirmek çok önemlidir. Bu durumda, termosikler'ın ısıtılmış kapağı ve kabın contası el ele çalışır. Farklı sızdırmazlık seçenekleri mevcutturPCR plakaları (bağlantı: Mühürleme maddesi), en iyi sızdırmazlık ısıyla sızdırmazlık yoluyla elde edilir. Döngü kapağının temas basıncı seçilen contaya ayarlanabildiği sürece diğer kapatmalar da uygun olabilir.
Uzun vadede doğru ve tekrarlanabilir sonuçları güvence altına almak için proses standardizasyonu uygulanmaktadır. Bu, ekipmanın her zaman iyi çalışma koşullarında olduğundan emin olmak için düzenli bakımını içerir. Üretilen tüm partilerde tüm sarf malzemeleri sürekli olarak yüksek kalitede olmalı ve güvenilir bulunabilirlikleri garanti edilmelidir.
Yayınlanma zamanı: 29-Kas-2022