การทำให้กระบวนการเป็นมาตรฐานนั้นรวมถึงการปรับปรุงประสิทธิภาพและการสร้างและปรับให้สอดคล้องกันในภายหลัง ซึ่งช่วยให้เกิดประสิทธิภาพสูงสุดในระยะยาว โดยไม่ขึ้นอยู่กับผู้ใช้ การทำให้เป็นมาตรฐานช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่มีคุณภาพสูง ตลอดจนสามารถทำซ้ำและเปรียบเทียบได้
เป้าหมายของ PCR แบบคลาสสิกคือการสร้างผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้ สำหรับการใช้งานบางประเภท ผลผลิตของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ก็มีความเกี่ยวข้องเช่นกัน สำหรับปฏิกิริยาเหล่านี้ จะต้องระมัดระวังเพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างจะไม่ได้รับผลกระทบ และเวิร์กโฟลว์ของ PCR ยังคงเสถียร โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การทำเช่นนี้จะช่วยลดการเกิดการปนเปื้อนที่อาจนำไปสู่ผลบวกปลอมหรือลบปลอม หรือแม้แต่ยับยั้งปฏิกิริยา PCR นอกจากนี้ เงื่อนไขของปฏิกิริยาจะต้องเหมือนกันมากที่สุดสำหรับแต่ละตัวอย่างภายในรอบการทำงาน และสามารถถ่ายโอนไปยังปฏิกิริยาที่ตามมา (โดยใช้วิธีเดียวกัน) ได้ ซึ่งหมายถึงองค์ประกอบของปฏิกิริยา ตลอดจนประเภทของการควบคุมอุณหภูมิในเครื่องไซเคิล แน่นอนว่าต้องหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดของผู้ใช้ให้มากที่สุด
ด้านล่างนี้ เราจะสาธิตความท้าทายที่พบระหว่างการเตรียมการและตลอดการดำเนินการ PCR รวมไปถึงแนวทางในการแก้ปัญหาที่มีอยู่เกี่ยวกับเครื่องมือและวัสดุสิ้นเปลืองที่ใช้สำหรับการทำให้เวิร์กโฟลว์ PCR เป็นมาตรฐาน
การเตรียมปฏิกิริยา
การกระจายส่วนประกอบของปฏิกิริยาลงในภาชนะ PCR หรือแผ่นตามลำดับ ประกอบไปด้วยความท้าทายหลายประการที่ต้องเอาชนะให้ได้:
สภาวะการเกิดปฏิกิริยา
การกำหนดปริมาณส่วนประกอบแต่ละส่วนให้ถูกต้องและแม่นยำนั้นมีความจำเป็นอย่างยิ่งเมื่อต้องการสร้างสภาวะปฏิกิริยาที่เหมือนกันมากที่สุด นอกเหนือจากเทคนิคการปิเปตที่ดีแล้ว การเลือกเครื่องมือที่เหมาะสมก็เป็นสิ่งสำคัญเช่นกัน มาสเตอร์มิกซ์ PCR มักประกอบด้วยสารที่เพิ่มความหนืดหรือสร้างฟอง ในระหว่างกระบวนการปิเปต สารเหล่านี้จะทำให้สารเปียกมากปลายปิเปตทำให้ความแม่นยำในการปิเปตลดลง การใช้ระบบจ่ายตรงหรือหัวปิเปตแบบอื่นที่มีโอกาสเปียกน้อยกว่าสามารถปรับปรุงความแม่นยำและความแม่นยำของกระบวนการปิเปตได้
การปนเปื้อน
ในระหว่างขั้นตอนการจ่ายสาร จะมีการสร้างละอองลอย ซึ่งหากปล่อยให้ละอองลอยเข้าไปในปิเปต อาจทำให้ตัวอย่างอื่นปนเปื้อนในขั้นตอนการปิเปตครั้งต่อไปได้ ซึ่งเราสามารถป้องกันได้โดยใช้หัวกรองหรือระบบการเคลื่อนย้ายโดยตรง
สินค้าสิ้นเปลือง เช่นเคล็ดลับภาชนะและแผ่นที่ใช้ในกระบวนการทำงาน PCR จะต้องไม่มีสารที่ก่อให้เกิดอันตรายต่อตัวอย่างหรือบิดเบือนผลลัพธ์ ได้แก่ DNA, DNases, RNases และสารยับยั้ง PCR รวมถึงส่วนประกอบที่อาจชะล้างออกจากวัสดุระหว่างปฏิกิริยาได้ ซึ่งเป็นสารที่เรียกว่าสารชะล้าง
ข้อผิดพลาดของผู้ใช้
ยิ่งมีการประมวลผลตัวอย่างมากเท่าไร ความเสี่ยงต่อข้อผิดพลาดก็จะยิ่งสูงขึ้นเท่านั้น อาจเกิดขึ้นได้ง่ายที่ตัวอย่างจะถูกปิเปตลงในภาชนะที่ไม่ถูกต้องหรือหลุมที่ไม่ถูกต้อง ความเสี่ยงนี้สามารถลดลงได้อย่างมากโดยการทำเครื่องหมายหลุมที่มองเห็นได้ง่าย ด้วยระบบอัตโนมัติของขั้นตอนการจ่าย ทำให้ "ปัจจัยด้านมนุษย์" เช่น ข้อผิดพลาดและความแปรผันที่เกี่ยวข้องกับผู้ใช้ลดลง ทำให้สามารถทำซ้ำได้มากขึ้น โดยเฉพาะในกรณีที่มีปริมาณปฏิกิริยาเพียงเล็กน้อย ซึ่งต้องใช้เพลทที่มีความเสถียรของมิติเพียงพอในเวิร์กสเตชัน บาร์โค้ดที่ติดไว้ช่วยให้เครื่องอ่านได้ง่ายขึ้น ซึ่งทำให้การติดตามตัวอย่างตลอดทั้งกระบวนการง่ายขึ้น
การตั้งโปรแกรมของเทอร์โมไซเลอร์
การเขียนโปรแกรมเครื่องมืออาจใช้เวลานานและอาจเกิดข้อผิดพลาดได้ ฟีเจอร์ต่างๆ ของเครื่อง PCR Thermal Cycler ทำงานร่วมกันเพื่อลดความซับซ้อนของขั้นตอนกระบวนการนี้ และที่สำคัญที่สุดคือทำให้ปลอดภัย:
การทำงานที่ง่ายและคำแนะนำที่ดีสำหรับผู้ใช้เป็นพื้นฐานของการเขียนโปรแกรมที่มีประสิทธิภาพ การบริหารจัดการผู้ใช้ที่ได้รับการป้องกันด้วยรหัสผ่านบนรากฐานนี้จะช่วยป้องกันไม่ให้ผู้ใช้คนอื่นแก้ไขโปรแกรมของตนเองได้ หากใช้โปรแกรมไซเคิลเลอร์หลายตัว (ประเภทเดียวกัน) จะเป็นประโยชน์หากสามารถถ่ายโอนโปรแกรมจากเครื่องมือหนึ่งไปยังอีกเครื่องมือหนึ่งโดยตรงผ่าน USB หรือการเชื่อมต่อ ซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์ช่วยให้สามารถบริหารจัดการโปรแกรม สิทธิ์ของผู้ใช้ และเอกสารบนคอมพิวเตอร์ได้จากส่วนกลางและปลอดภัย
การทำงาน PCR
ในระหว่างการทำงาน DNA จะถูกขยายในภาชนะปฏิกิริยา ซึ่งแต่ละตัวอย่างจะต้องถูกทำให้เป็นไปตามเงื่อนไขปฏิกิริยาที่เหมือนกันและสม่ำเสมอ ประเด็นต่อไปนี้มีความเกี่ยวข้องกับกระบวนการ:
การควบคุมอุณหภูมิ
ความแม่นยำที่ยอดเยี่ยมในการควบคุมอุณหภูมิและความสม่ำเสมอของบล็อกไซเคิลเกอร์เป็นพื้นฐานสำหรับการปรับอุณหภูมิที่สม่ำเสมอของตัวอย่างทั้งหมด คุณภาพสูงขององค์ประกอบความร้อนและความเย็น (องค์ประกอบเพลเทียร์) เช่นเดียวกับวิธีที่เชื่อมต่อองค์ประกอบเหล่านี้กับบล็อก เป็นปัจจัยสำคัญที่จะกำหนดความเสี่ยงของความคลาดเคลื่อนของอุณหภูมิที่เรียกว่า “เอฟเฟกต์ขอบ”
การระเหย
ความเข้มข้นของส่วนประกอบของปฏิกิริยาแต่ละส่วนไม่ควรเปลี่ยนแปลงในระหว่างการเกิดปฏิกิริยาเนื่องจากการระเหย มิฉะนั้น อาจเป็นไปได้ว่าจะมีปริมาณน้อยมากผลิตภัณฑ์พีซีอาร์อาจเกิดขึ้นหรือไม่มีเลยก็ได้ ดังนั้น จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องลดการระเหยให้เหลือน้อยที่สุดโดยให้แน่ใจว่ามีการปิดผนึกอย่างแน่นหนา ในกรณีนี้ ฝาที่อุ่นของเครื่องเทอร์โมไซเคลอร์และซีลของภาชนะจะทำงานควบคู่กัน มีตัวเลือกการปิดผนึกที่แตกต่างกันสำหรับแผ่น PCR (ลิงค์: บทความการปิดผนึก)โดยวิธีการปิดผนึกที่ดีที่สุดคือการปิดผนึกด้วยความร้อน อาจใช้การปิดผนึกแบบอื่นได้เช่นกัน ตราบเท่าที่สามารถปรับแรงกดสัมผัสของฝาปิดเครื่องซีลให้ตรงกับซีลที่เลือก
มีการกำหนดมาตรฐานกระบวนการเพื่อรักษาผลลัพธ์ที่แม่นยำและทำซ้ำได้ในระยะยาว ซึ่งรวมถึงการบำรุงรักษาอุปกรณ์เป็นประจำเพื่อให้แน่ใจว่าอุปกรณ์อยู่ในสภาพการทำงานที่ดีอยู่เสมอ วัสดุสิ้นเปลืองทั้งหมดควรมีคุณภาพสูงสม่ำเสมอในทุกล็อตที่ผลิต และต้องรับประกันความพร้อมใช้งานที่เชื่อถือได้
เวลาโพสต์: 29 พ.ย. 2565