Standardizarea proceselor include optimizarea acestora și stabilirea și armonizarea ulterioară, permițând performanțe optime pe termen lung – independent de utilizator. Standardizarea asigură rezultate de înaltă calitate, precum și reproductibilitatea și comparabilitatea acestora.
Scopul PCR-ului (clasic) este generarea unui rezultat fiabil și reproductibil. Pentru anumite aplicații, randamentulProdus PCReste, de asemenea, relevant. Pentru aceste reacții, trebuie acordată atenție pentru a se asigura că probele nu sunt compromise și că fluxul de lucru PCR rămâne stabil. Mai exact, acest lucru se traduce prin minimizarea introducerii contaminărilor care ar putea duce la rezultate fals pozitive sau fals negative sau chiar ar putea inhiba reacția PCR. În plus, condițiile de reacție ar trebui să fie cât mai identice posibil pentru fiecare probă individuală dintr-o rundă și, de asemenea, să fie transferabile la reacțiile ulterioare (cu aceeași metodă). Aceasta se referă la compoziția reacțiilor, precum și la tipul de control al temperaturii din ciclator. Desigur, erorile utilizatorului trebuie evitate pe cât posibil.
Mai jos, vom demonstra provocările întâlnite în timpul pregătirii și pe parcursul execuției unui PCR – precum și abordările soluțiilor existente în ceea ce privește instrumentele și consumabilele utilizate pentru standardizarea fluxurilor de lucru PCR.
Prepararea reacției
Distribuirea componentelor de reacție în vase PCR, respectiv plăci, prezintă multiple provocări care trebuie depășite:
Condiții de reacție
Dozarea exactă și precisă a componentelor individuale este indispensabilă atunci când se urmăresc condiții de reacție cât mai identice posibil. Pe lângă o tehnică bună de pipetare, alegerea instrumentului potrivit este esențială. Master-mixurile PCR conțin frecvent substanțe care cresc vâscozitatea sau generează spumă. În timpul procesului de pipetare, acestea duc la umectarea substanțială a...vârfuri de pipetă, reducând astfel precizia pipetării. Utilizarea sistemelor de dozare directă sau a vârfurilor de pipetă alternative, care sunt mai puțin predispuse la umezire, poate îmbunătăți acuratețea și precizia procesului de pipetare.
Contaminări
În timpul procesului de distribuire, se generează aerosoli care, dacă ajung în interiorul pipetei, pot contamina o altă probă în timpul următoarei etape de pipetare. Acest lucru poate fi prevenit prin utilizarea vârfurilor cu filtru sau a sistemelor de deplasare directă.
Consumabile precumsfaturiVasele și plăcile utilizate în fluxul de lucru PCR nu trebuie să conțină substanțe care compromit proba sau falsifică rezultatul. Acestea includ ADN, DNazele, RNazele și inhibitorii PCR, precum și componente care se pot scurge din material în timpul reacției - substanțe cunoscute sub numele de substanțe levigabile.
Eroare utilizator
Cu cât sunt procesate mai multe probe, cu atât este mai mare riscul de eroare. Se poate întâmpla cu ușurință ca o probă să fie pipetată în vasul greșit sau în godeul greșit. Acest risc poate fi redus considerabil prin marcarea ușor de observat a godeurilor. Prin automatizarea etapelor de distribuire, „factorul uman”, adică erorile și variațiile legate de utilizator, sunt reduse la minimum, crescând astfel reproductibilitatea, în special în cazul volumelor mici de reacție. Acest lucru necesită utilizarea unor plăci cu o stabilitate dimensională suficientă într-o stație de lucru. Codurile de bare atașate oferă o lizibilitate suplimentară de către mașină, ceea ce simplifică urmărirea probelor pe parcursul întregului proces.
Programarea termociclatorului
Programarea unui instrument se poate dovedi a fi o activitate consumatoare de timp și predispusă la erori. Diferite caracteristici ale termociclatorului PCR lucrează împreună pentru a simplifica această etapă a procesului și, cel mai important, pentru a o face sigură:
Operarea ușoară și o bună îndrumare a utilizatorului stau la baza unei programări eficiente. Bazându-se pe această fundație, administrarea utilizatorilor protejată prin parolă va împiedica modificarea propriilor programe de către alți utilizatori. Dacă se utilizează mai multe cicluri (de același tip), este benefic dacă un program poate fi transferat direct de la un instrument la altul prin USB sau conectivitate. Software-ul permite administrarea centralizată și securizată a programelor, drepturilor utilizatorilor și documentelor pe un computer.
Rulare PCR
În timpul experimentului, ADN-ul este amplificat în vasul de reacție, unde fiecare probă trebuie supusă unor condiții de reacție identice și consistente. Următoarele aspecte sunt relevante pentru proces:
Controlul temperaturii
Precizia excelentă în controlul temperaturii și omogenitatea blocului de ciclare stau la baza condiționării uniforme a temperaturii tuturor probelor. Calitatea înaltă a elementelor de încălzire și răcire (elemente Peltier), precum și modul în care acestea sunt conectate la bloc, sunt factorii decisivi care vor determina riscul discrepanțelor de temperatură cunoscute sub numele de „efect de margine”.
Evaporare
Concentrațiile componentelor individuale ale reacției nu ar trebui să se modifice pe parcursul reacției din cauza evaporării. În caz contrar, este posibil ca foarte puțină cantitate să se modifice.Produs PCRse poate genera o cantitate mare de apă sau deloc. Prin urmare, este crucial să se minimizeze evaporarea prin asigurarea unei etanșări sigure. În acest caz, capacul încălzit al termociclatorului și etanșarea vasului funcționează mână în mână. Sunt disponibile diferite opțiuni de etanșare pentruPlăci PCR (link: articol despre etanșare), prin care cea mai bună etanșare se realizează prin termosudare. Pot fi potrivite și alte tipuri de închidere, atâta timp cât presiunea de contact a capacului ciclatorului poate fi ajustată în funcție de etanșarea selectată.
Standardizarea proceselor este implementată pentru a garanta rezultate precise și reproductibile pe termen lung. Aceasta include întreținerea regulată a echipamentului pentru a se asigura că acesta este întotdeauna în stare bună de funcționare. Toate consumabilele trebuie să fie de o calitate constantă și ridicată în toate loturile produse, iar disponibilitatea lor fiabilă trebuie garantată.
Data publicării: 29 noiembrie 2022