PCRワークフロー(標準化による品質向上)

プロセスの標準化には、プロセスの最適化、そしてそれに続く確立と調和が含まれ、ユーザーに依存しない長期的な最適なパフォーマンスを実現します。標準化により、高品質な結果が保証されるだけでなく、再現性と比較可能性も確保されます。

(従来の)PCRの目的は、信頼性と再現性のある結果を得ることです。特定の用途では、PCR産物も関連しています。これらの反応では、サンプルが損なわれないように、またPCRワークフローが安定しているように注意する必要があります。具体的には、偽陽性または偽陰性の結果、あるいはPCR反応の阻害につながる可能性のあるコンタミネーションの混入を最小限に抑えることが重要です。さらに、反応条件は、ラン内の各サンプルについて可能な限り同一であり、後続の反応(同じメソッド)にも適用可能である必要があります。これは、反応の組成だけでなく、サイクラーの温度制御の種類にも当てはまります。もちろん、ユーザーによるミスは可能な限り回避する必要があります。

以下では、PCR の準備中および実行中に遭遇する課題と、PCR ワークフローの標準化に使用される機器および消耗品に関する解決策へのアプローチについて説明します。

反応の準備

反応成分をPCR容器またはプレートに分配する際には、克服しなければならない複数の課題があります。

反応条件

可能な限り均一な反応条件を得るためには、個々の成分を正確かつ精密に計量することが不可欠です。優れたピペッティング技術に加え、適切なツールの選択も重要です。PCRマスターミックスには、粘度を高めたり泡を発生させたりする物質が含まれていることが多く、ピペッティングプロセス中にこれらの物質がマスターミックスに大きく浸み込んでしまいます。ピペットチップピペッティングの精度が低下します。直接ディスペンシングシステムや、濡れにくい代替ピペットチップを使用することで、ピペッティングプロセスの精度と精密度を向上させることができます。

汚染

分注プロセス中にエアロゾルが生成され、これがピペット内部に到達すると、次のピペッティングステップで別のサンプルを汚染する可能性があります。これは、フィルターチップまたは直接置換システムを使用することで防止できます。
消耗品などヒントPCRワークフローで使用する容器やプレートには、サンプルの品質を損なったり、結果を歪めたりする物質が含まれていてはなりません。これには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害薬、そして反応中に材料から浸出する可能性のある成分(いわゆる浸出物)が含まれます。

ユーザーエラー

処理するサンプル数が増えるほど、エラーのリスクが高まります。サンプルを間違った容器やウェルにピペットで分注してしまうことは容易に起こり得ます。ウェルに分かりやすいマーキングを施すことで、このリスクを大幅に低減できます。分注工程の自動化により、「人的要因」、つまりエラーやユーザーによるばらつきが最小限に抑えられ、特に反応量が少ない場合の再現性が向上します。そのためには、ワークステーションで使用するプレートに十分な寸法安定性が求められます。バーコードを添付することで機械による読み取りが容易になり、プロセス全体を通してサンプルの追跡が簡素化されます。

サーモサイクラーのプログラミング

機器のプログラミングは時間がかかり、エラーが発生しやすい場合があります。PCRサーマルサイクラーのさまざまな機能が連携することで、このプロセスステップが簡素化され、そして何よりも安全性が確保されます。
簡単な操作と優れたユーザーガイダンスは、効率的なプログラミングの基盤となります。この基盤の上に、パスワード保護されたユーザー管理機能により、他のユーザーによるプログラムの変更を防止できます。複数のサイクラー(同種)を使用している場合、USBまたはUSBケーブルを介して、プログラムをある装置から別の装置に直接転送できると便利です。コンピュータソフトウェアは、プログラム、ユーザー権限、およびドキュメントをコンピュータ上で一元的かつ安全に管理することを可能にします。

PCR検査

実験中、DNAは反応容器内で増幅されます。各サンプルは同一かつ一貫した反応条件に晒される必要があります。このプロセスには以下の点が関連します。

温度制御

サイクラーブロックの優れた温度制御精度と均一性は、あらゆるサンプルを均一に温度制御するための基盤です。加熱・冷却素子(ペルチェ素子)の高品質と、これらをブロックに接続する方法が、「エッジ効果」と呼ばれる温度差のリスクを決定づける要因となります。

蒸発

反応中の各成分の濃度は、蒸発によって変化してはならない。そうでなければ、反応中にほとんど変化しない可能性がある。PCR産物蒸発は、生成される場合もあれば、全く生成されない場合もあります。そのため、確実な密閉を確保して蒸発を最小限に抑えることが重要です。この場合、サーモサイクラーの加熱蓋と容器の密閉が連携して機能します。様々な密閉オプションをご用意しています。PCRプレート(リンク:シーリング記事)ヒートシールにより最適な密閉性が得られます。サイクラーの蓋の接触圧を選択したシールに合わせて調整できる限り、他の閉鎖方法も適しています。

長期にわたって正確で再現性の高い結果を確保するために、プロセスの標準化が図られています。これには、機器が常に良好な動作状態を維持するための定期的なメンテナンスが含まれます。すべての消耗品は、生産ロット全体にわたって一貫して高品質でなければならず、確実に入手可能であることが保証されなければなりません。

 


投稿日時: 2022年11月29日