La standardizzazione dei processi include la loro ottimizzazione e la successiva definizione e armonizzazione, consentendo prestazioni ottimali a lungo termine, indipendentemente dall'utente. La standardizzazione garantisce risultati di alta qualità, nonché la loro riproducibilità e comparabilità.
L'obiettivo della PCR (classica) è la generazione di un risultato affidabile e riproducibile. Per alcune applicazioni, la resa delProdotto PCRAnche questo aspetto è rilevante. Per queste reazioni, è necessario prestare attenzione a garantire che i campioni non vengano compromessi e che il flusso di lavoro della PCR rimanga stabile. Nello specifico, ciò si traduce nel ridurre al minimo l'introduzione di contaminanti che potrebbero portare a risultati falsi positivi o falsi negativi o persino inibire la reazione di PCR. Inoltre, le condizioni di reazione devono essere il più possibile identiche per ogni singolo campione all'interno di una corsa e trasferibili anche alle reazioni successive (con lo stesso metodo). Questo si riferisce alla composizione delle reazioni e al tipo di controllo della temperatura nel termociclatore. Naturalmente, gli errori dell'utente devono essere evitati il più possibile.
Di seguito illustreremo le sfide che si incontrano durante la preparazione e l'intera esecuzione di una PCR, nonché gli approcci alle soluzioni esistenti per quanto riguarda gli strumenti e i materiali di consumo utilizzati per la standardizzazione dei flussi di lavoro della PCR.
Preparazione della reazione
La distribuzione dei componenti della reazione nei contenitori o piastre PCR, rispettivamente, comporta molteplici sfide che devono essere superate:
Condizioni di reazione
Il dosaggio esatto e preciso dei singoli componenti è indispensabile per ottenere condizioni di reazione il più possibile identiche. Oltre a una buona tecnica di pipettaggio, è fondamentale la scelta dello strumento giusto. Le master-mix per PCR contengono spesso sostanze che aumentano la viscosità o generano schiuma. Durante il processo di pipettaggio, queste sostanze portano a una notevole bagnatura del campione.punte per pipette, riducendo così la precisione del pipettaggio. L'uso di sistemi di erogazione diretta o di puntali alternativi meno soggetti a bagnatura può migliorare l'accuratezza e la precisione del processo di pipettaggio.
Contaminazioni
Durante il processo di dispensazione, si generano aerosol che, se introdotti all'interno della pipetta, potrebbero contaminare un altro campione durante la successiva fase di pipettaggio. Questo può essere evitato utilizzando puntali con filtro o sistemi a spostamento diretto.
Materiali di consumo comesuggerimentiI contenitori e le piastre utilizzati nel flusso di lavoro PCR non devono contenere sostanze che compromettano il campione o falsifichino il risultato. Tra queste, DNA, DNasi, RNasi e inibitori della PCR, nonché componenti che potrebbero potenzialmente rilasciarsi dal materiale durante la reazione, ovvero sostanze note come "leachables".
Errore dell'utente
Maggiore è il numero di campioni trattati, maggiore è il rischio di errore. Può accadere facilmente che un campione venga pipettato nel contenitore o nel pozzetto sbagliato. Questo rischio può essere notevolmente ridotto contrassegnando i pozzetti in modo ben visibile. Grazie all'automazione delle fasi di dispensazione, il "fattore umano", ovvero errori e variazioni dovute all'utente, viene ridotto al minimo, aumentando così la riproducibilità, soprattutto in caso di piccoli volumi di reazione. Ciò richiede l'impiego di piastre con sufficiente stabilità dimensionale in una postazione di lavoro. I codici a barre applicati garantiscono un'ulteriore leggibilità automatica, semplificando la tracciabilità del campione durante l'intero processo.
Programmazione del termociclatore
La programmazione di uno strumento può rivelarsi dispendiosa in termini di tempo e soggetta a errori. Diverse funzionalità del termociclatore per PCR collaborano per semplificare questa fase del processo e, soprattutto, renderla sicura:
La semplicità d'uso e una buona guida utente sono alla base di una programmazione efficiente. Su questa base, l'amministrazione utente protetta da password impedirà che i propri programmi vengano modificati da altri utenti. Se si utilizzano più termociclatori (dello stesso tipo), è utile che un programma possa essere trasferito direttamente da uno strumento all'altro tramite USB o connettività. Il software per computer consente la gestione centralizzata e sicura di programmi, diritti utente e documenti su un computer.
Esecuzione PCR
Durante la corsa, il DNA viene amplificato nel recipiente di reazione, dove ogni campione deve essere sottoposto a condizioni di reazione identiche e costanti. I seguenti aspetti sono rilevanti per il processo:
Controllo della temperatura
L'eccellente accuratezza nel controllo della temperatura e l'omogeneità del blocco termostatato sono alla base di un condizionamento termico uniforme di tutti i campioni. L'elevata qualità degli elementi riscaldanti e raffreddanti (elementi Peltier), nonché il modo in cui questi sono collegati al blocco, sono fattori decisivi che determinano il rischio di discrepanze di temperatura, note come "effetto bordo".
Evaporazione
Le concentrazioni dei singoli componenti della reazione non dovrebbero variare nel corso della reazione a causa dell'evaporazione. In caso contrario, è possibile che si verifichi una quantità molto piccolaProdotto PCRpuò essere generato, o non essere generato affatto. È quindi fondamentale ridurre al minimo l'evaporazione garantendo una tenuta sicura. In questo caso, il coperchio riscaldato del termociclatore e la tenuta del contenitore lavorano di pari passo. Sono disponibili diverse opzioni di tenuta perPiastre PCR (link: articolo sulla sigillatura), dove la migliore tenuta si ottiene tramite termosaldatura. Possono essere adatte anche altre chiusure, purché la pressione di contatto del coperchio del termociclatore possa essere regolata in base alla tenuta scelta.
La standardizzazione dei processi è in atto per garantire risultati accurati e riproducibili a lungo termine. Ciò include la manutenzione regolare delle apparecchiature per garantirne il costante funzionamento. Tutti i materiali di consumo devono essere di qualità costantemente elevata per tutti i lotti prodotti e la loro affidabile disponibilità deve essere garantita.
Data di pubblicazione: 29 novembre 2022