A estandarización dos procesos inclúe a súa optimización e o seu posterior establecemento e harmonización, o que permite un rendemento óptimo a longo prazo, independentemente do usuario. A estandarización garante resultados de alta calidade, así como a súa reproducibilidade e comparabilidade.
O obxectivo da PCR (clásica) é a xeración dun resultado fiable e reproducible. Para certas aplicacións, o rendemento doProduto de PCRtamén é relevante. Para estas reaccións, débese ter coidado para garantir que as mostras non se vexan comprometidas e que o fluxo de traballo da PCR permaneza estable. En concreto, isto tradúcese en minimizar a introdución de contaminacións que poderían levar a resultados falsos positivos ou falsos negativos ou mesmo inhibir a reacción da PCR. Ademais, as condicións de reacción deben ser o máis idénticas posible para cada mostra individual dentro dunha execución e tamén ser transferibles a reaccións posteriores (do mesmo método). Isto refírese á composición das reaccións, así como ao tipo de control de temperatura no ciclador. Por suposto, os erros do usuario deben evitarse na medida do posible.
A continuación, demostraremos os desafíos que se atopan durante a preparación e ao longo da execución dunha PCR, así como as solucións que existen con respecto aos instrumentos e consumibles utilizados para a estandarización dos fluxos de traballo da PCR.
Preparación da reacción
A dosificación dos compoñentes da reacción en recipientes ou placas de PCR, respectivamente, presenta múltiples desafíos que deben superarse:
Condicións de reacción
A dosificación exacta e precisa dos compoñentes individuais é indispensable cando se buscan as condicións de reacción máis idénticas posibles. Ademais dunha boa técnica de pipeteado, a selección da ferramenta axeitada é fundamental. As mesturas mestras para PCR adoitan conter substancias que aumentan a viscosidade ou xeran escuma. Durante o proceso de pipeteado, isto provoca unha humidade substancial do...puntas de pipeta, o que reduce a precisión do pipeteado. O uso de sistemas de dispensación directa ou puntas de pipeta alternativas que sexan menos propensas a mollarse pode mellorar a precisión do proceso de pipeteado.
Contaminacións
Durante o proceso de dispensación, xéranse aerosois que, se se lles permite chegar ao interior da pipeta, poden contaminar outra mostra durante o seguinte paso de pipeteado. Isto pódese evitar empregando puntas de filtro ou sistemas de desprazamento directo.
Consumibles comoconsellosOs recipientes e as placas que se empregan no fluxo de traballo da PCR non deben conter substancias que comprometan a mostra ou falsifiquen o resultado. Entre elas inclúense ADN, DNases, RNases e inhibidores da PCR, así como compoñentes que poidan lixiviarse do material durante a reacción (substancias coñecidas como lixiviables).
Erro do usuario
Cantas máis mostras se procesen, maior será o risco de erro. Pode ocorrer facilmente que unha mostra se pipetee no recipiente ou no pozo incorrecto. Este risco pódese reducir considerablemente mediante unha marcaxe facilmente discernible dos pozos. Mediante a automatización dos pasos de dispensación, minimízase o "factor humano", é dicir, os erros e as variacións relacionadas co usuario, o que aumenta a reproducibilidade, especialmente no caso de pequenos volumes de reacción. Isto require que as placas teñan suficiente estabilidade dimensional para ser empregadas nunha estación de traballo. Os códigos de barras adxuntos proporcionan unha lexibilidade adicional por máquina, o que simplifica o seguimento da mostra durante todo o proceso.
Programación do termociclador
Programar un instrumento pode resultar longo e propenso a erros. Diferentes características do termociclador de PCR funcionan conxuntamente para simplificar este paso do proceso e, o máis importante, para facelo seguro:
Un manexo sinxelo e unha boa guía para o usuario son a base dunha programación eficiente. Baseándose neste alicerce, a administración de usuarios protexida por contrasinal evitará que outros usuarios modifiquen os propios programas. Se se usan varios termocicladores (do mesmo tipo), é beneficioso que un programa se poida transferir directamente dun instrumento a outro mediante USB ou conectividade. O software informático permite a administración centralizada e segura de programas, dereitos de usuario e documentos nun ordenador.
Execución da PCR
Durante a execución, o ADN amplifícase no recipiente de reacción, onde cada mostra debe someterse a condicións de reacción idénticas e consistentes. Os seguintes aspectos son relevantes para o proceso:
Control de temperatura
A excelente precisión no control da temperatura e a homoxeneidade do bloque do ciclador son a base para un acondicionamento uniforme da temperatura de todas as mostras. A alta calidade dos elementos de calefacción e refrixeración (elementos Peltier), así como a forma en que estes están conectados ao bloque, son os factores decisivos que determinarán o risco de discrepancias de temperatura coñecidas como "efecto bordo".
Evaporación
As concentracións dos compoñentes individuais da reacción non deberían cambiar ao longo da reacción debido á evaporación. Se non, é posible que moi poucaProduto de PCRpode xerarse, ou non xerarse en absoluto. Polo tanto, é crucial minimizar a evaporación garantindo un selo seguro. Neste caso, a tapa quente do termociclador e o selo do recipiente funcionan da man. Hai diferentes opcións de selado dispoñibles paraPlacas PCR (ligazón: artigo sobre selado), polo que a mellor selaxe se consegue mediante selado por calor. Outros peches tamén poden ser axeitados, sempre que a presión de contacto da tapa do ciclador se poida axustar á selaxe seleccionada.
Existe unha estandarización dos procesos para salvagardar resultados precisos e reproducibles a longo prazo. Isto inclúe o mantemento regular do equipo para garantir que sempre estea en bo estado de funcionamento. Todos os consumibles deben ser dunha calidade consistente en todos os lotes producidos e débese garantir a súa dispoñibilidade fiable.
Data de publicación: 29 de novembro de 2022