La standardisation des processus comprend leur optimisation, puis leur mise en place et leur harmonisation, permettant ainsi une performance optimale à long terme, quel que soit l'utilisateur. La standardisation garantit des résultats de haute qualité, ainsi que leur reproductibilité et leur comparabilité.
L'objectif de la PCR (classique) est de générer un résultat fiable et reproductible. Pour certaines applications, le rendement de laproduit PCRest également pertinent. Pour ces réactions, il est essentiel de veiller à ce que les échantillons ne soient pas compromis et à ce que le processus de PCR reste stable. Plus précisément, cela se traduit par la minimisation de l'introduction de contaminations susceptibles d'entraîner des résultats faussement positifs ou faussement négatifs, voire d'inhiber la réaction PCR. De plus, les conditions de réaction doivent être aussi identiques que possible pour chaque échantillon d'une série et transférables aux réactions suivantes (de la même méthode). Cela concerne la composition des réactions ainsi que le type de contrôle de la température dans le cycleur. Les erreurs d'utilisation doivent bien sûr être évitées autant que possible.
Ci-dessous, nous démontrerons les défis rencontrés lors de la préparation et tout au long du déroulement d’une PCR – et les approches de solutions qui existent en ce qui concerne les instruments et les consommables utilisés pour la standardisation des flux de travail de la PCR.
Préparation de la réaction
La distribution des composants de réaction dans les récipients PCR, ou plaques, respectivement, comporte de multiples défis qui doivent être surmontés :
Conditions de réaction
Le dosage exact et précis des composants individuels est indispensable pour obtenir des conditions de réaction aussi homogènes que possible. Outre une bonne technique de pipetage, le choix de l'outil adéquat est crucial. Les mastermix PCR contiennent souvent des substances qui augmentent la viscosité ou génèrent de la mousse. Lors du pipetage, ces substances entraînent un mouillage important de la solution.pointes de pipette, réduisant ainsi la précision du pipetage. L'utilisation de systèmes de distribution directe ou d'embouts de pipette alternatifs, moins sujets au mouillage, peut améliorer la précision du pipetage.
Contaminations
Lors du processus de distribution, des aérosols sont générés. S'ils pénètrent à l'intérieur de la pipette, ils peuvent contaminer un autre échantillon lors de l'étape de pipetage suivante. L'utilisation de pointes à filtre ou de systèmes de déplacement direct permet d'éviter ce problème.
Consommables tels queconseilsLes récipients et les plaques utilisés dans le cadre de la PCR ne doivent contenir aucune substance susceptible de compromettre l'échantillon ou de fausser le résultat. Il s'agit notamment d'ADN, d'ADNases, d'ARNases et d'inhibiteurs de PCR, ainsi que de composants susceptibles de se lixivier du matériau pendant la réaction (substances dites « relargables »).
Erreur de l'utilisateur
Plus le nombre d'échantillons traités est élevé, plus le risque d'erreur est élevé. Il peut facilement arriver qu'un échantillon soit pipeté dans le mauvais récipient ou le mauvais puits. Ce risque peut être considérablement réduit grâce à un marquage facilement identifiable des puits. L'automatisation des étapes de distribution minimise le facteur humain, c'est-à-dire les erreurs et les variations liées à l'utilisateur, ce qui augmente la reproductibilité, notamment pour les petits volumes de réaction. Cela nécessite l'utilisation de plaques présentant une stabilité dimensionnelle suffisante au poste de travail. Les codes-barres intégrés offrent une meilleure lisibilité par machine, ce qui simplifie le suivi des échantillons tout au long du processus.
Programmation du thermocycleur
La programmation d'un instrument peut s'avérer chronophage et source d'erreurs. Différentes fonctionnalités des thermocycleurs PCR s'associent pour simplifier cette étape du processus et, surtout, la sécuriser :
Une utilisation simple et un guidage utilisateur efficace sont la base d'une programmation efficace. Sur cette base, une gestion des utilisateurs protégée par mot de passe empêche toute modification des programmes par d'autres utilisateurs. Si plusieurs cycleurs (du même type) sont utilisés, il est avantageux de pouvoir transférer un programme directement d'un instrument à l'autre via USB ou une connexion Internet. Un logiciel permet une gestion centralisée et sécurisée des programmes, des droits d'utilisateur et des documents sur un ordinateur.
Exécution de la PCR
Pendant l'analyse, l'ADN est amplifié dans le réacteur, où chaque échantillon doit être soumis à des conditions de réaction identiques et homogènes. Les aspects suivants sont importants pour le processus :
Contrôle de la température
L'excellente précision du contrôle de la température et l'homogénéité du bloc cycleur sont essentielles pour un conditionnement thermique uniforme de tous les échantillons. La qualité des éléments chauffants et refroidissants (éléments Peltier), ainsi que leur connexion au bloc, sont des facteurs déterminants pour le risque d'écarts de température, appelés « effet de bord ».
Évaporation
Les concentrations des différents composants de la réaction ne doivent pas varier au cours de la réaction en raison de l'évaporation. Sinon, il est possible que très peu deproduit PCRIl peut y avoir une production d'évaporation, voire aucune. Il est donc crucial de minimiser l'évaporation en assurant une étanchéité parfaite. Dans ce cas, le couvercle chauffant du thermocycleur et l'étanchéité de la cuve fonctionnent de concert. Différentes options d'étanchéité sont disponibles.Plaques PCR (lien : article sur le scellement), la meilleure étanchéité étant obtenue par thermoscellage. D'autres fermetures peuvent également convenir, à condition que la pression de contact du couvercle du cycleur puisse être ajustée au joint sélectionné.
La standardisation des processus est en place afin de garantir des résultats précis et reproductibles à long terme. Cela inclut un entretien régulier des équipements pour garantir leur bon fonctionnement. Tous les consommables doivent être de qualité constante sur tous les lots produits, et leur disponibilité doit être garantie.
Date de publication : 29 novembre 2022