استانداردسازی فرآیندها شامل بهینهسازی و متعاقباً استقرار و هماهنگسازی آنها میشود که امکان عملکرد بهینه بلندمدت - مستقل از کاربر - را فراهم میکند. استانداردسازی، نتایج با کیفیت بالا و همچنین تکرارپذیری و مقایسهپذیری آنها را تضمین میکند.
هدف PCR (کلاسیک) تولید یک نتیجه قابل اعتماد و تکرارپذیر است. برای کاربردهای خاص، بازده ...محصول PCRنیز مرتبط است. برای این واکنشها، باید دقت شود که نمونهها به خطر نیفتند و گردش کار PCR پایدار بماند. به طور خاص، این به معنای به حداقل رساندن ورود آلودگیهایی است که میتوانند منجر به نتایج مثبت کاذب یا منفی کاذب شوند یا حتی واکنش PCR را مهار کنند. علاوه بر این، شرایط واکنش باید تا حد امکان برای هر نمونه در یک اجرا یکسان باشد و همچنین به واکنشهای بعدی (با همان روش) قابل انتقال باشد. این به ترکیب واکنشها و همچنین نوع کنترل دما در چرخهساز اشاره دارد. البته، باید تا حد امکان از خطاهای کاربر جلوگیری شود.
در ادامه، چالشهایی که در طول آمادهسازی و در طول اجرای PCR با آنها مواجه میشویم - و رویکردهای موجود برای راهحلها در رابطه با ابزارها و مواد مصرفی مورد استفاده برای استانداردسازی گردش کار PCR - را نشان خواهیم داد.
آمادهسازی واکنش
توزیع اجزای واکنش به داخل ظروف PCR یا پلیتها، به ترتیب، شامل چالشهای متعددی است که باید بر آنها غلبه کرد:
شرایط واکنش
دوز دقیق و صحیح اجزای منفرد هنگام دستیابی به یکسانترین شرایط واکنش ممکن ضروری است. علاوه بر تکنیک خوب پیپتینگ، انتخاب ابزار مناسب نیز بسیار مهم است. مسترمیکسهای PCR اغلب حاوی موادی هستند که ویسکوزیته را افزایش میدهند یا کف ایجاد میکنند. در طول فرآیند پیپتینگ، این مواد منجر به خیس شدن قابل توجه محلول میشوند.نوک پیپتو در نتیجه دقت پیپتینگ را کاهش میدهد. استفاده از سیستمهای توزیع مستقیم یا سرپیپتهای جایگزین که کمتر مستعد خیس شدن هستند، میتواند دقت و صحت فرآیند پیپتینگ را بهبود بخشد.
آلودگیها
در طول فرآیند توزیع، آئروسلهایی تولید میشوند که اگر به داخل پیپت برسند، میتوانند به طور بالقوه نمونه دیگری را در مرحله بعدی پیپت آلوده کنند. با استفاده از نوکهای فیلتر یا سیستمهای جابجایی مستقیم میتوان از این امر جلوگیری کرد.
مواد مصرفی مانندنکاتظروف، وکیومها و پلیتهایی که در گردش کار PCR استفاده میشوند، نباید حاوی موادی باشند که نمونه را به خطر میاندازند یا نتیجه را تحریف میکنند. این مواد شامل DNA، DNases، RNases و مهارکنندههای PCR و همچنین اجزایی هستند که ممکن است به طور بالقوه در طول واکنش از مواد نشت کنند - موادی که به عنوان مواد قابل نشت شناخته میشوند.
خطای کاربر
هرچه نمونههای بیشتری پردازش شوند، خطر خطا بیشتر میشود. به راحتی ممکن است نمونهای با پیپت به ظرف اشتباه یا چاهک اشتباه ریخته شود. این خطر را میتوان با علامتگذاری قابل تشخیص چاهکها به میزان قابل توجهی کاهش داد. از طریق اتوماسیون مراحل توزیع، «عامل انسانی»، یعنی خطاها و تغییرات مربوط به کاربر، به حداقل میرسد و در نتیجه تکرارپذیری، به ویژه در مورد حجمهای کوچک واکنش، افزایش مییابد. این امر مستلزم استفاده از صفحات با ثبات ابعادی کافی در یک ایستگاه کاری است. بارکدهای پیوست شده، قابلیت خواندن ماشینی بیشتری را فراهم میکنند که ردیابی نمونه را در کل فرآیند ساده میکند.
برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر
برنامهریزی یک دستگاه میتواند زمانبر و همچنین مستعد خطا باشد. ویژگیهای مختلف دستگاه ترموسایکلر PCR با هم کار میکنند تا این مرحله از فرآیند را ساده کرده و از همه مهمتر، آن را ایمن سازند:
کارکرد آسان و راهنمایی خوب کاربر، اساس برنامهنویسی کارآمد است. با تکیه بر این پایه، مدیریت کاربر با رمز عبور از تغییر برنامههای شخصی توسط سایر کاربران جلوگیری میکند. اگر چندین چرخهساز (از یک نوع) در حال استفاده هستند، مفید است که یک برنامه بتواند مستقیماً از یک دستگاه به دستگاه دیگر از طریق USB یا اتصال منتقل شود. نرمافزار رایانهای، مدیریت مرکزی و ایمن برنامهها، حقوق کاربر و اسناد را در رایانه امکانپذیر میکند.
اجرای PCR
در طول آزمایش، DNA در ظرف واکنش تکثیر میشود، جایی که هر نمونه باید تحت شرایط واکنش یکسان و ثابتی قرار گیرد. جنبههای زیر برای این فرآیند مرتبط هستند:
کنترل دما
دقت عالی در کنترل دما و همگنی بلوک سیکلر، اساس تهویه دمایی یکنواخت همه نمونهها است. کیفیت بالای عناصر گرمایشی و سرمایشی (عناصر پلتیر) و همچنین نحوه اتصال آنها به بلوک، عوامل تعیینکنندهای هستند که خطر اختلاف دما را که به عنوان "اثر لبه" شناخته میشود، تعیین میکنند.
تبخیر
غلظت اجزای واکنش به صورت جداگانه نباید در طول واکنش به دلیل تبخیر تغییر کند. در غیر این صورت، ممکن است مقدار بسیار کمیمحصول PCRممکن است تولید شود، یا اصلاً تولید نشود. بنابراین، به حداقل رساندن تبخیر با اطمینان از آببندی ایمن بسیار مهم است. در این حالت، درب گرم شده ترموسایکلر و آببندی ظرف با هم کار میکنند. گزینههای مختلف آببندی برای ... در دسترس است.صفحات PCR (لینک: مقاله آببندی)که در آن بهترین آببندی از طریق آببندی حرارتی حاصل میشود. سایر درپوشها نیز ممکن است مناسب باشند، به شرطی که فشار تماس درب چرخاننده را بتوان با آببندی انتخاب شده تنظیم کرد.
استانداردسازی فرآیند به منظور حفظ نتایج دقیق و تکرارپذیر در درازمدت انجام میشود. این شامل نگهداری منظم تجهیزات برای اطمینان از عملکرد صحیح آنها میشود. تمام مواد مصرفی باید در تمام مراحل تولید از کیفیت بالایی برخوردار باشند و در دسترس بودن قابل اعتماد آنها باید تضمین شود.
زمان ارسال: ۲۹ نوامبر ۲۰۲۲